Ανοσοβιολογική μελέτη της εμπλοκής των ερυθροκυττάρων στους παθογενετικούς μηχανισμούς της μη αλκοολικής ηπατικής νόσου

Abstract

In the present dissertation we focused on the role of red blood cells in immunometabolism and lipotoxicity. Specifically, we studied the role of red blood cells in the immunopathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).NAFLD is a liver disease that occurs in approximately 25% of the world's population, and is initially characterized by fat accumulation in at least 5% of hepatocytes, lack of alcohol and hepatotoxic drugs, and viral liver infection. Gradually, the liver's ability to accumulate fat in the form of triacylglycerols is overcome, resulting in the formation of other products of lipid metabolism, such as sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid (LPA) and cholesterol. Activation of inflammatory pathways, inhibition of insulin signaling and organelle dysfunction can eventually lead to the patient transitioning from steatosis to steatohepatitis, fibrosis, cirrhosis, hepatocellular carcinoma, and even hepatocellular carcinoma.According to the multiple hits hypothesis for the pathogenesis of NAFLD, lipotoxicity, insulin resistance, endoplasmic reticulum stress, mitochondrial dysfunction, autophagy disorder, oxidative stress, release of DFAMPs, the change in the intestinal microbiome and the subcellular populations of the immune cells, act in parallel and mutually reinforce each other. However, to date, there is no approved treatment for NAFLD, which, in addition to the natural course and epidemiology of the disease, causes huge financial costs for health systems worldwide.Red blood cells, in addition to supplying oxygen to and eliminating carbon dioxide from the tissues, have additional functions. In particular, among others, erythrocyte i) is the main source of S1P in the blood, ii) is a major source of LPA in the blood, iii) is actively involved in the reverse transport of cholesterol to the liver, iv) binds and releases chemokines, v) releases cytokines that have been synthesized during differentiation, vi) affects the functional phenotype of macrophages, T lymphocytes, neutrophils and dendritic cells. In addition, recent studies suggest that the accumulation of toxic lipids and a high-fat diet turn red blood cells into a pro-inflammatory cell.Therefore, in this study we decided, firstly, to examine the levels of lipids: S1P, LPA, cholesterol and cytokines: MCP1, RANTES, MIP1β, IL-8, IL-1β, IL-12p40, IL-17, TNF-α, IFN-γ released from the red blood cells of NAFLD patients in comparison to healthy volunteers. It was found that red blood cells from patients release more chemokine MCP1 (P <0.05), but no difference was observed in the other factors. Next, we examined the effect of conditioned media of erythrocytes of patients and healthy volunteers on the release of cytokines from macrophages RAW 264.7 in vitro. Our results show that patient erythrocytes induce increased release of TNF-α from macrophages (P <0.05). Next, the relationship of sphingomyelin of the erythrocyte membrane with the pattern of cytokines released from it was examined. For this reason, we developed a quantitative thin layer chromatographic method for sphingomyelin, based on the intensity of the three primary colors, and compared 10 methods for isolating it from erythrocytes. The method was linear at a wide range of concentrations (0.25-10 μg / spot). The best results were given for the sum of green and red. The slope for green + red is y = -13.973x + 391.85 and R2 = 0.9636. The method quite successfully separates cholesterol, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinostol, phosphatidylserine, phosphatidylcholine and sphingomyelin. The dynamic range of the methods was found to be 0.25-200 μg. The limits of detection and quantification were 0.137 μg and 0.41 μg, respectively. The average accuracy, expressed as % recovery, was 0.9101 ± 0.006. The coefficient of variation for all concentrations was less than 0.52%, indicating excellent repeatability. Then, after comparing 9 methods with the Folch method (method 1) which was calibrated as 100% extraction yield, we concluded that the use of methanol as the extraction solvent method provides the best yield (135.35 ± 1.04%). The methanol method is statistically significant (p <0.05) more efficient than the other 8/9 methods tested. With this method, erythrocyte membrane sphingomyelin in patients with NALFD was significantly lower than healthy controls (829.82 ± 511.60 vs 1892.08 ± 606.25 μg / ml packaged erythrocytes) (p <0.001). Also, in patients, the levels of MCP1 released by erythrocytes are negatively correlated with membrane sphingomyelin levels (speraman’s correlation = -0.53, p <0.05, pearson’s correlation = -0.46, p <0.05). To investigate the mechanisms of release of MCP1 from erythrocytes, we examined the effect of the P2X7 receptor agonist on MCP1 levels, but also the role of cholesterol removal from the erythrocyte through cyclodextrin in the above process. Activation of the P2X7 receptor leads to increased release of the chemokine MCP1 (50.06 ± 1.04 pg / ml) compared with erythrocytes in the absence of stimulation (34.34 ± 4.4 pg / ml) (p <0.05). Removal of cholesterol via cyclodextrin prior to stimulation resulted in decreased MCP1 release from erythrocytes (41.77 ± 1.00 pg / ml) (p <0.05). These results indicate that red blood cells sense and respond to tissue damage by recruiting and possibly activating macrophages. In addition, the role of erythrocyte cholesterol merits further investigation, since our results imply a pro-inflammatory role.Our study demonstrates the role of erythrocytes in inflammation of the liver during NAFLD. The results of our study reinforce the belief that red blood cells are actively involved in NAFLD immunometabolic events. Further studies could lead to the discovery of new molecular therapeutic targets for NAFLD.Our results highlight the role of red blood cells in systemic immunometabolism, connecting the systemic metabolic status with the immune response.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάσαμε στον ρόλο των ερυθρών αιμοσφαιρίων στον ανοσομεταβολισμό και τη λιποτοξικότητα. Συγκεκριμένα, μελετήσαμε το ρόλο των ερυρθών αιμοσφαιρίων στην ανοσοπαθογένεση της μη αλκοολικής λιπώδους ηπατικής νόσου (NAFLD). Η NAFLD είναι μία νόσος του ήπατος που παρατηρείται περίπου στο 25% του παγκόσμιου πληθυσμού, και χαρακτηρίζεται αρχικά από συσσώρευση λίπους τουλάχιστον στο 5% των ηπατοκυττάρων, απουσία κατανάλωσης αλκοόλ και ηπατοτοξικών φαρμάκων και ιογενούς λοίμωξης του ήπατος. Σταδιακά, η ικανότητα του ήπατος να συσσωρεύει λίπος στη μορφή τριακυλογλυκερολών υπερνικάται, με αποτέλεσμα το σχηματισμό άλλων προϊόντων του μεταβολισμού των λιπιδίων, όπως η 1-φωσφορική σφιγγοσίνη (S1P), το λυσοφωσφατιδικό οξύ (LPA) και η χοληστερόλη. Η ενεργοποίηση φλεμονώδων μονοπατιών, η παρεμπόδιση της σηματοδότησης της ινσουλίνης και η πρόκληση δυσλειτουργίας των κυτταρικών οργανιδίων, μπορεί να οδηγήσει τελικά σε μετάβαση του ασθενούς από τη στεάτωση, στη στεατοηπατίτιδα, την ίνωση, την κίρρωση, το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, ακόμα και το θάνατο. Σύμφωνα με τη θεωρία των παράλληλων πολλαπλών χτυπημάτων για την παθογένεια της NAFLD, η λιποτοξικότητα, η αντίσταση στην ινσουλίνη, το στρες του ενδοπλασματικού δικτύου, η δυσλειτουργία του μιτοχονδρίου, η διαταραχή της αυτοφαγίας, το οξειδωτικό στρες, o κυτταρικός θάνατος, η απελευθέρωση μοριακών μοτίβων βλάβης (DAMP), η μεταβολή του εντερικού μικροβιώματος και των υποκυτταρικών πληθυσμών των ανοσοκυττάρων, δρουν παράλληλα και αλληλοενισχύονται. Παρ’ αυτά, δεν υπάρχει μέχρι σήμερα εγκεκριμένη θεραπεία για την αντιμετώπιση της NAFLD, κάτι το οποίο, εκτός από τη φυσική πορεία και την επιδημιολογία της νόσου, προκαλεί και τεράστια οικονομικά κόστη για τα συστήματα υγείας παγκοσμίως. Το ερυθρό αιμοσφαίριο, πέρα από την παροχή οξυγόνου προς- και την αποβολή διοξειδίου του άνθρακα από- τους ιστούς έχει πρόσθετες λειτουργίες. Συγκεκριμένα, μεταξύ άλλων, i) αποτελεί την κύρια πηγή S1P στο αίμα, ii) αποτελεί μία βασικά πηγή LPA στο αίμα, iii) συμμετέχει ενεργά στην αντίστροφή μεταφορά χοληστερόλης προς το ήπαρ, iv) προσδένει και απελευθερώνει χημειοκίνες, v) απελευθερώνει κυτταροκίνες που έχουν συντεθεί κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης, vi) επηρεάζει το λειτουργικό φαινότυπο των μακροφάγων, των Τ λεμφοκυττάρων, των ουδετερόφιλων και των δενδριτικών κυττάρων. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν πως η συσσώρευση τοξικών λιπιδίων και η διατροφή πλούσια σε λίπος μετατρέπουν το ερυθρό αιμοσφαίριο σε ένα προ-φλεγμονώδες κύτταρο. Επομένως, σε αυτή τη μελέτη αποφασίσαμε, σε πρώτο χρόνο, να εξετάσουμε τα επίπεδα των λιπιδίων: S1P, LPA, χοληστερόλης και των κυτταροκινών: MCP1, RANTES, MIP1β, IL-8, IL-1β, IL-12p40, IL-17, TNF-α, IFN-γ που απελευθερώνονται από τα ερυθρά αιμοσφαίρια ασθενών NAFLD σε σχέση με υγιείς εθελοντές. Βρέθηκε πως τα ερυθρά αιμοσφαίρια από ασθενείς απελευθερώνουν περισσότερη χημειοκίνη MCP1 (P<0.05), χωρίς όμως να παρατηρηθεί κάποια διαφορά στους άλλους παράγοντες. Εν συνεχεία, εξετάσαμε την επίδραση των conditioned media ερυθροκυττάρων ασθενών και υγιών εθελοντών στην απελευθέρωση κυτταροκινών από μακροφάγα RAW 264.7 in vitro. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν πως τα ερυθροκύτταρα ασθενών προκαλούν αυξημένη απελευθέρωση TNF-α από τα μακροφάγα (P<0.05). Έπειτα, εξετάστηκε η σχέση της σφιγγομυελίνης της μεμβράνης του ερυθροκυττάρου με το πρότυπο των απελευθερώμενων κυτταροκινών από αυτό. Για το λόγο αυτό, αναπτύξαμε μία ποσοτική μέθοδο χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας για τη σφιγγομυελίνη με βάση την ένταση των τριών βασικών χρωμάτων, και συγκρίναμε 10 μεθόδους για την απομόνωσή της από τα ερυθροκύτταρα. Η μέθοδος ήταν γραμμική σε ένα ευρύ φάσμα συγκεντρώσεων (0,25-10 μg / spot). Τα καλύτερα αποτελέσματα δόθηκαν για το άθροισμα πράσινου και κόκκινου χρώματος. Η κλίση για το πράσινο+ κόκκινο χρώμα είναι y = -13,973x+391,85 και το R2 = 0,9636. Η μέθοδος διαχωρίζει αρκετά ικανοποιητικά τη χοληστερόλη, τη φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη, την φωσφατιδυλοϊνοστόλη, τη φωσφατιδυλοσερίνη, τη φωσφατιδυλοχολίνη και τη σφιγγομυελίνη. Το δυναμικό εύρος των μεθόδων βρέθηκε να είναι 0,1-200 μg. Τα όρια ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισμού ήταν 0,137 μg και 0,41 μg, αντίστοιχα. Η μέση ακρίβεια, εκφραζόμενη ως % ανάκτηση, ήταν 0,9101 ± 0,006. Ο συντελεστής διακύμανσης για όλες τις συγκεντρώσεις ήταν μικρότερος του 0,52%, υποδεικνύοντας άριστη επαναληψιμότητα. Έπειτα, αφού συγκρίναμε 9 μεθόδους με τη μέθοδο Folch (μέθοδος 1) που βαθμονομήθηκε ως απόδοση εκχύλισης 100%, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η χρήση μεθανόλης ως μέθοδος διαλύτη εκχύλισης παρέχει την καλύτερη απόδοση (135,35 ± 1,04%). Η μέθοδος μεθανόλης είναι σταστιστικά σημαντικά (p<0.05) πιο αποδοτική από τις 8/9 υπόλοιπες μεθόδους που εξετάστηκαν. Με τη μέθοδο αυτή, η σφιγγομυελίνη της μεμβράνης ερυθροκυττάρων σε ασθενείς με NALFD ήταν σημαντικά χαμηλότερη από τους υγιείς μάρτυρες (829.82±511.60 vs 1892.08±606.25 μg/ml συσκευασμένων ερυθροκυττάρων) (p <0.001). Ακόμη, στους ασθενείς τα επίπεδα της MCP1 που απελευθερώνεται από τα ερυθροκύτταρα σχετίζονται αρνητικά με τα επίπεδα της μεμβρανικής σφιγγομυελίνης (speraman’s correlation =-0,53, p<0.05, pearson’s correlation=-0,46, p<0.05). Για τη διερεύνηση των μηχανισμών απελευθέρωσης της MCP1 από τα ερυθροκύτταρα, εξετάσαμε την επίδραση του αγωνιστή του υποδοχέα P2X7 στα επίπεδα της MCP1, αλλά και το ρόλο της απομάκρυνσης χοληστερόλης από το ερυθροκύτταρο μέσω κυκλοδεξτρίνης στην παραπάνω διαδικασία. Η ενεργοπoίηση του υποδοχέα P2X7 οδηγεί στην αυξημένη απελευθέρωση της χημειοκίνης MCP1 (50,06±1,04 pg/ml) σε σχέση με τα ερυθροκύτταρα απουσία διέγερσης (34,34± 4,4) (p<0.05). Η αφαίρεση χοληστερόλης μέσω κυκλοδεξτρίνης πριν την διέγερση οδήγησε σε μείωση της απελευθέρωσης MCP1 από τα ερυθροκύτταρα (41,77±1,00) (p<0.05). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα ερυθρά αιμοσφαίρια αισθάνονται και ανταποκρίνονται σε βλάβη των ιστών με τη στρατολόγηση και πιθανώς ενεργοποίηση των μακροφάγων. Επιπλέον, ο ρόλος της χοληστερόλης ερυθροκυττάρων αξίζει περαιτέρω διερεύνηση, καθώς τα αποτελέσματά μας υπονοούν έναν προφλεγμονώδη ρόλο.Η μελέτη μας καταδεικνύει το ρόλο των ερυθροκυττάρων στη φλεγμονή του ήπατος κατά την NAFLD. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας ενισχύουν την πεποίθηση ότι τα ερυθρά αιμοσφαίρια συμμετέχουν ενεργά στα ανοσομεταβολικά γεγονότα της NAFLD. Περαιτέρω μελέτες θα μπορούσαν να οδηγήσουν στην ανακάλυψη νέων μοριακών θεραπευτικών στόχων για την NAFLD. Τα αποτελέσματά μας καθιστούν σαφή τον ρόλο των ερυθροκυττάρων στον συστημικό ανοσομεταβολισμό, συνδέοντας το συστημικό μεταβολικό περιβάλλον με την ανοσιακή απόκριση.