Ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα Prox1 στη ρύθμιση της διαφοροποίησης και ωρίμανσης των νευρικών κυττάρων κατά την ανάπτυξη του κεντρικού νευρικού συστήματος

Abstract

During central nervous system (CNS) development, proper and timely induction of neurite and axon elongation is critical for generating functional, mature neurons and neuronal networks. Despite the wealth of information on the action of extracellular cues, little is known about the intrinsic gene regulatory factors that control this developmental decision. Here, we report the identification of Prox1, a homeobox transcription factor, as a key player in inhibiting neurite and axon elongation. Although Prox1 promotes acquisition of early neuronal identity and is expressed in nascent post-mitotic neurons, it is heavily down-regulated in the majority of terminally differentiated neurons, indicating a regulatory role in delaying axon outgrowth in newly formed neurons. Consistently, we show that Prox1 is sufficient to inhibit neurite extension in neuroblastoma cell lines. Furthermore, shRNA-mediated knock-down of Prox1 in Neuro2A cells induces the extension of neurites. More importantly, Prox1 overexpression suppresses axon elongation in primary neuronal cultures as well as in the developing mouse brain, while Prox1 knock-down promotes axon outgrowth. Mechanistically, RNA-Seq analysis reveals that Prox1 affects critical pathways for neuronal maturation and neurite extension. Interestingly, Prox1 strongly inhibits many components of Ca2+ signaling pathway, an important mediator of neurite and axon extension and neuronal maturation. In accordance, Prox1 represses Ca2+ entry upon KClmediated depolarization and reduce CREB phosphorylation. These observations suggest that Prox1 acts as a potent suppressor of neurite and axon elongation by inhibiting Ca2+ signaling pathway. This action may provide the appropriate time window for nascent neurons to find the correct position in the CNS prior to initiation of axon and/or neurite elongation.

Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του κεντρικού νευρικού συστήματος, η κατάλληλη και στο σωστό χρόνο επαγωγή της επιμήκυνσης των νευριτών και ειδικότερα του άξονα είναι πολύ σημαντική για την ανάπτυξη λειτουργικών, ώριμων νευρώνων και νευρωνικών δικτύων. Παρόλο την πληθώρα των πληροφοριών για τη δράση εξωκυττάριων παραγόντων, λίγα είναι γνωστά για τους ενδοκυτταρικούς μηχανισμούς μεταγραφικής ρύθμισης που επιδρούν σε αυτή την αναπτυξιακή διαδικασία. Στην παρούσα εργασία υποδεικνύεται ότι ο Prox1 ομοιοτικός(homeobox) μεταγραφικός παράγοντας δρα ως ένας βασικός παράγοντας για την καταστολή της επέκτασης του νευρικού άξονα και ίσως και των υπόλοιπων νευριτών. Αν και ο Prox1 είναι υπεύθυνος για την επαγωγή της ταυτότητας των νεοσχηματιζόμενων μετα-μιτωτικών νευρικών κυττάρων στα οποία και εκφράζεται, η έκφραση του καταστέλλεται έντονα στην πλειοψηφία των τελικά διαφοροποιημένων νευρικών κυττάρων. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει έναν αρνητικό ρυθμιστικό ρόλο του Prox1 στην επιμήκυνση του άξονα και των νευριτών στα νεαρά νευρικά κύτταρα. Σε συμφωνία με αυτόν το ρόλο, η παρούσα εργασία υπέδειξε ότι ο Prox1 είναι ικανός να μειώσει την επέκταση των νευριτών σε κύτταρα νευροβλαστώματος. Αντίθετα, παρατηρήθηκε αύξηση της επέκτασης των νευριτών σε κύτταρα νευροβλαστώματος όπου είχε κατασταλεί η έκφραση του Prox1 με τη χρήση shRNA πλασμιδιακού φορέα. Επιπλέον, η υπερέκφραση του Prox1 κατέστειλε την επιμήκυνση του άξονα σε πρωτογενή νευρικά κύτταρα και στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο μυός, ενώ η μείωση της έκφρασης οδήγησε σε επαγωγή. Για τη διερεύνηση του μηχανισμού δράσης του Prox1 πραγματοποιήθηκε RNA-Seq ανάλυση με την οποία διαπιστώθηκε ότι ο Prox1 επιδρά σε πολλά μονοπάτια που σχετίζονται με την παραπάνω διεργασία και γενικότερα με τη νευρική ωρίμανση. Επίσης, σημαντικό ήταν ότι τα αποτελέσματα του RNA-Seq ανέδειξαν ότι ο Prox1 επηρεάζει πολλούς παράγοντες που λαμβάνουν μέρος στο μονοπάτι του ασβεστίου, το οποίο αποτελεί σημαντικό διαμεσολαβητή της επιμήκυνσης του άξονα και της νευρικής ωρίμανσης. Τα παραπάνω είναι σε συμφωνία με μία σειρά πειραμάτων όπου υποδείχθηκε ότι ο Prox1 οδηγεί σε μείωση της εισροής ιόντων ασβεστίου μετά από εκπόλωση της μεμβράνης των νευρικών κυττάρων μέσω της διέγερσης με KCl. Παράλληλα μειώνεται και η φωσφορυλίωση του CREB παράγοντα, βασικού καταρροϊκού στόχου του μονοπατιού του Ca2+. Συνολικά, όλες οι παραπάνω παρατηρήσεις υποδηλώνουν μια ισχυρή κατασταλτική δράση του Prox1 στην επέκταση του άξονα και ίσως και των υπόλοιπων νευριτών μέσω της καταστολής του μονοπατιού του ασβεστίου. Αυτή η δράση θα μπορούσε να παρέχει το κατάλληλο χρονικό διάστημα ώστε τα νεαρά νευρικά κύτταρα να βρουν την τελική τους θέση στο κεντρικό νευρικό σύστημα, πριν την έναρξη της επιμήκυνσης του άξονα και/ή των υπόλοιπων νευριτών.