Συγκριτική μελέτη στελεχών Aeromonas veronii ως νοσογόνου παράγοντα σε εκτρεφόμενα λαβράκια: ανάπτυξη αυτεμβολίων για την πρόληψη της ασθένειας

Abstract

The object of the study was a bacterial disease affecting farmed European seabass caused by Aeromonas veronii bv. sobria. The disease affects farmed sea bass weighing> 50 g on fish farms in the Aegean Sea, mainly in the west. It occurs in temperature > 21-22oC, while the outbreaks occur mainly in the summer months. The cumulative mortality can reach up to 80% of the farmed population. The current study concerns an emerging pathology for seabass fish farming and was initially considered a local, individual case. The pathology and epidemiological features of the disease were studied. Pathogen diversity was studied with molecular (16S rRNA and gyrB) and biochemical (Biolog and API20E) tools. As part of the work, a genus-based detection protocol was developed. The infectivity of the pathogen was tested in vivo, with experimental infections in healthy seabass and zebrafish and in vitro, on a blood agar medium. The genomes of representative strains were sequenced, and the phylogenetic relationships and the antigenic nature and diversity of the pathogen were studied. Τhe principles of reverse vaccinology were applied to detect conserved membrane proteins–antigens for the development of the widely used Aeromonas veronii vaccine. Finally, a bacterial vaccine (water and oil-based) was developed. The efficacy of the vaccine was tested by challenge tests on the vaccinated fish, by measuring the titer of antibodies (ELISA) in the blood serum and by the expression of selected genes related to the immune system via qPCR. Three phenotypes of the pathogen were identified which are distinguished in terms of motility and pigment production and correspond to different regions of the Aegean Sea. Strains from different regions were almost (ppsA) indistinguishable with the studied housekeeping genes used as genetic markers. The symptoms of the disease were reproduced in artificial infections in seabass, confirming the pathogenicity of A. veronii. The use of zebrafish for the study of bacterial infectivity in Greek fish farming species is encouraged by the results since infections induced mortality in zebrafish too. Genomic analyses showed high similarity between A. veronii strains of seabass in different regions of the Aegean Sea. However, their differentiation was possible by single nucleotide polymorphisms corresponding to the phenotypic groups mentioned above and the different geographical origins of the strains (East /West Aegean). The outer membrane antigenic proteins also showed a high degree of similarity at the amino acid sequence, but differences were found in the S-layer protein, maltoporin LamB, and O-antigen, suggesting the use of a multivalent vaccine for Aegean seabass culture. The injectable bivalent adjuvanted (NS+PDB+Montanide) vaccine offered protection to adult seabass against bath challenge with strain PDB (RPS = 62.5%). The aqueous bivalent (NS + PDB) vaccine administered by immersion in seabass fry also provided protection against strain PDB (RPS = 89.4%). The antibody titer for NS and PDB antigens was stable for at least 60 days after injection vaccination with bivalent adjuvanted (NS+PDB+Montanide) vaccine. Gene expression of MHCII-β, IgM and especially TCR-β genes in the head kidney tissue increased up to day 15 after vaccination by injection with aqueous and adjuvanted injectable vaccine with strain NS, while cellular immunity (CD4) appears to be activated on day 30 only in the group vaccinated with the adjuvanted preparation. The results produced here encourage the use of autogenous vaccines for the control of A. veronii disease in farmed European seabass. Boost vaccinations and/or increased antigen doses are proposed in the future to increase the vaccine efficacy.

Αντικείμενο της μελέτης είναι ασθένεια εκτρεφόμενων λαβρακιών που οφείλεται στο βακτήριο Aeromonas veronii bv. sobria. Η ασθένεια επηρεάζει εκτρεφόμενα λαβράκια βάρους > 50 g σε ιχθυοτροφικές εκμεταλλεύσεις στο Αιγαίο, κυρίως δυτικά. Εμφανίζεται σε θερμοκρασίες > 18oC ενώ οι εξάρσεις σημειώνονται κυρίως τους θερινούς μήνες σε θερμοκρασία > 21oC. Η αθροιστική θνησιμότητα μπορεί να φτάσει μέχρι το 80% του εκτρεφόμενου πληθυσμού. Η εργασία αφορά αναδυόμενη παθολογία για την ιχθυοκαλλιέργεια λαβρακιού και αρχικά αποτέλεσε/θεωρήθηκε τοπικό και μεμονωμένο περιστατικό. Μελετήθηκε η παθολογία και τα επιδημιολογικά χαρακτηριστικά της ασθένειας. Η ποικιλότητα των βακτηριακών στελεχών του παθογόνου μελετήθηκε με μοριακά (16S rRNA και gyrB) και βιοχημικά (Biolog και API20E) εργαλεία. Στα πλαίσια της εργασίας αναπτύχθηκε πρωτόκολλο ανίχνευσης του γένους. Η λοιμογονικότητα του παθογόνου ελέγχθηκε in vivo με πειραματικές μολύνσεις σε υγιή λαβράκια και zebrafish και in vitro σε στερεό αιματούχο θρεπτικό υπόστρωμα. Αλληλουχήθηκαν τα γονιδιώματα αντιπροσωπευτικών στελεχών και μελετήθηκαν οι φυλογενετικές σχέσεις, και η αντιγονική φύση και ποικιλότητα του παθογόνου. Εφαρμόστηκαν οι αρχές της αντίστροφης εμβολιολογίας για τον εντοπισμό συντηρημένων μεμβρανικών πρωτεϊνών–αντιγόνων και την επιλογή στελεχών για την ανάπτυξη εμβολίου Aeromonas veronii ευρείας εφαρμογής. Τέλος, παρασκευάστηκε εμβόλιο βακτηρίνης (υδατοδιαλυτό και ελαιώδες). Ελέγχθηκε η αποτελεσματικότητα του εμβολίου με τεχνητή μόλυνση των εμβολιασμένων ιχθύων, καθώς και με τη μέτρηση του τίτλου αντισωμάτων (ELISA) στον ορό του αίματος και τον έλεγχο έκφρασης επιλεγμένων γονιδίων που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό σύστημα μέσω qPCR. Εντοπίστηκαν τρεις φαινότυποι του παθογόνου που διακρίνονται ως προς την κινητικότητα και την παραγωγή χρωστικής και αντιστοιχούν σε διαφορετικές περιοχές του Αιγαίου. Τα στελέχη διαφορετικών περιοχών δεν διακρίνονται μεταξύ τους με τα γονίδια οικιακής οικονομίας που εξετάστηκαν πλην του ppsA. Τα συμπτώματα της ασθένειας αναπαρήχθησαν στις τεχνητές μολύνσεις σε λαβράκι, επιβεβαιώνοντας την παθογονικότητα του A. veronii. Η χρήση zebrafish για τη μελέτη μολυσματικότητας βακτηρίων στα είδη της ελληνικής ιχθυοκαλλιέργειας ενθαρρύνεται από τα αποτελέσματα εφόσον, όπως και στο λαβράκι προκλήθηκε θνησιμότητα των μολυσμένων ατόμων. Οι γονιδιωματικές αναλύσεις έδειξαν υψηλή ομοιότητα μεταξύ των στελεχών A. veronii από λαβράκι στις διαφορετικές περιοχές του Αιγαίου. Ωστόσο, η διάκριση τους έγινε εφικτή μέσω των σημειακών νουκλεοτιδικών πολυμορφισμών που αντιστοιχούν στις φαινοτυπικές ομάδες που αναφέρθηκαν παραπάνω και στη διαφορετική γεωγραφική προέλευση των στελεχών (Ανατολικό/Δυτικό Αιγαίο). Οι αντιγονικές πρωτεΐνες της εξωτερικής μεμβράνης παρουσίασαν επίσης υψηλό ποσοστό ομοιότητας σε επίπεδο αμινoξικής αλληλουχίας, εντοπίστηκαν ωστόσο διαφορές στην πρωτεΐνη S-layer, τη maltoporin LamB και το O-antigen που συνηγορούν στη χρήση πολυσθενούς εμβολίου για το εκτρεφόμενο στο Αιγαίο λαβράκι. Το ελαιώδες δισθενές (NS+PDB+Montanide) εμβόλιο βακτηρίνης που χορηγήθηκε με ένεση σε ενήλικα λαβράκια έδωσε προστασία στον εμβολιασμένο πληθυσμό έναντι μόλυνσης με μπάνιο με το στέλεχος PDB (RPS = 62.5%). Το υδατικό δισθενές (NS+PDB) εμβόλιο που χορηγήθηκε με εμβάπτιση σε ιχθύδια λαβρακιού έδωσε επίσης προστασία έναντι του στελέχους PDB (RPS = 89,4%). Ο τίτλος αντισωμάτων για τα αντιγόνα NS και PDB διατηρήθηκε σταθερός για τουλάχιστον 60 ημέρες μετά τον εμβολιασμό με ένεση με το ελαιώδες δισθενές (NS+PDB+Montanide) εμβόλιο. Η γονιδιακή έκφραση των γονιδίων MHCII-β, IgM και κυρίως του TCR-β στον μεσονεφρικό ιστό παρουσίασε αυξητική τάση μέχρι την ημέρα 15 μετά τον εμβολιασμό με ενέσιμο ελαιώδες και υδατικό εμβόλιο με το στέλεχος NS, ενώ η κυτταρική ανοσία (CD4) φαίνεται να ενεργοποιείται την ημέρα 30 μόνο στην ομάδα που εμβολιάστηκε με την ελαιώδη παρασκευή. Με τα αποτελέσματα που παρήχθησαν εδώ ενθαρρύνεται η χρήση των αυτεμβολίων για την αντιμετώπιση ασθενειών έναντι του παθογόνου A. veronii. Η εφαρμογή επαναληπτικών εμβολιασμών ή/και η αύξηση της δόσης αντιγόνου στα επί μέρους εμβόλια προτείνονται μελλοντικά για την αύξηση της αποτελεσματικότητας των εμβολίων.