Αξιολόγηση και βελτίωση της ανθεκτικότητας της φακής έναντι βιοτικών και αβιοτικών καταπονήσεων

Abstract

Lentil crop is subjected to a plethora of biotic and abiotic stresses, which are limiting its growth and development, while causing significant yield losses. In this context, crop’s viability is to a great extent dependent on the effective control of the most detrimental stress factors. To this endeavor, the use of varieties genetically resistant against major stresses is the most efficient, sustainable and economic approach. Based on the severity of effects, drought, increased salinity and Fusarium wilt, caused by the fungus Fusarium oxysporum f. sp. lentis (Fol), are the most destructive stresses for the lentil crop. Given the lack of research data regarding the mechanisms governing resistance against such stresses, and the lack of suitable methods to select resistant genotypes, this PhD dissertation initially focused on the evaluation of lentil germplasm for resistance against drought and high salinity as well as the identification of isolates causing Fusarium wilt in Greek lentil cultivation zones. The research was subsequently targeted at studying lentil’s metabolic response to drought and Fusarium wilt as a means to gain insights into the molecular mechanisms governing resistance against such stresses. Finally, the research aimed at optimizing an efficient protocol for lentil transformation, suitable for exploitation in gene expression studies. Chapters 2 and 3 aimed at investigating the possibilities of evaluating lentil’s resistance against drought and salinity, based on seed germination and seedling growth potential under stress conditions. The findings point to the drastic effects of stress in growth and development, while, at the same time, underline the possibility of employing this method for revealing genetic variability related to resistance against drought and salinity. In this line, varieties ¨Elpida¨, ¨Samos¨ and ¨Thessalia¨ showed the best performance under drought conditions, while ¨Samos¨ proved the most resistant variety against salt stress. Overall data provide evidence for the suitability of this method for the purposes of conducting early selections for resistant genotypes. Provided that the reliability of such findings is validated, based on their correlation with data deriving from filed experimentation, this approach is anticipated to considerably upgrade the efficiency of breeding procedures targeted at improving abiotic stress tolerance in lentil. In Chapter 4, the metabolic response of lentil germplasm to drought stress was determined as a means to gain knowledge related to the biochemical mechanisms regulating resistance as well as the identification of biomarkers to be introgressed into selection procedures for drought resistance. To this purpose, the study aimed at determining the metabolic profile of two lentil varieties, whose difference with respect to drought resistance has been proven in the evaluation performed in Chapter 3. The analysis revealed the significant effects of drought stress on lentil’s metabolism, with the effects of stress being subjected to significant genotypic dependency. Apart from differences identified to a pool of metabolites with differing biological properties (at the level of variety, their interaction, stress intensity as well as stress intensity), the analysis revealed the differential expression of D-fructose, a,a-trehalose, myo inositol and L-tryptophan in the resistant and sensitive varieties, thus providing possibilities for their exploitation as biomarkers for resistance. Given the lack of data related to the pathogen that causes Fusarium wilt in lentil crop in Greek cultivation zones, the study aimed at characterizing the isolates found in major country’s zones (Chapter 5). Soil samples were collected from fields, where plants showed typical symptoms of Fusarium wilt, and, following pathogen isolation, Fusarium spp. was identified based on both macroscopic and microscopic observations. Molecular characterization of isolates was employed through in silico analysis of sequences coding for TEF-1α, b-tubulin and calmodulin genes. With respect to TEF-1α gene, the analysis revealed high sequence similarity with isolates of Fusarium spp. (99 %), with isolates deriving from the regions of Leukada and Florina, where lentil is cultivated as monoculture, showed high homology with Fol. The analysis of b-tubulin και calmodulin genes, revealed high similarity with isolates of F. oxysporum, yet identification of forma specialis could not be obtained (f.sp. lentis). To our knowledge, such preliminary study is a first attempt towards characterizing the isolates of Fusarium spp. in Greek lentil cultivation zones. The collection of such data may positively contribute to the design of suitable breeding schemes for upgrading lentil’s resistance against Fusarium wilt. In the context of developing cultivars endowed with resistance against Fusarium wilt, obtaining molecular data related to the biological system Fol-lentil is anticipated to significantly enhance all relative breeding procedures. In this line, Chapter 6 focused on comparatively evaluating the metabolic response of two lentil varieties, differing with respect to disease resistance, under conditions of artificial Fol-inoculation. Apart from gaining significant knowledge regarding the defense mechanisms against the disease, the study aimed at identifying markers for early selecting Fol-resistant genotypes. The GC/MS analysis of root and leaf metabolic profiles allowed for the detection of compound whose accumulation differed significantly at the level of variety and/or treatment and/or their interaction. The findings underline the presence of significant differences in the metabolic content between the resistant and the susceptible variety but also between Fol-inoculated plants and controls. In addition to changes identified in a good number of metabolites, overall data highlighted the significant contribution of palatinol and L-proline 2 in the metabolic response of roots and shoots respectively, thus suggesting possibilities of their exploitation as potential biomarkers for characterization of lentil germplasm with respect to Fol-resistance. Given lentil’s recalcitrance to genetic transformation and tissue regeneration, the study further aimed at developing a fast and efficient protocol for lentil transformation through the Agrobacterium rhizogenes (Chapter 7). In this context, optimization involved the use of three different bacterial strains (R1000, K599 and Arqua) and culture media differing in composition, mainly with respect to the presence of acetosyringone and MES as inducing factors to transformation efficiency. The findings indicate the positive effect of strain R1000, combined with media enrichment with acetosyringone/MES, in transformation frequency. The transgenic nature of roots was verified through the presence of rolB2 gene and the simultaneous absence of virCD sequence of A. rhizogenes. Overall findings underline that transformation, via A. rhizogenes, provides an alternative approach for inducing the generation of transgenic tissues in lentil, whose recalcitrance significantly limits all efforts aimed at stable transformation and whole plant regeneration. This study is an initial attempt towards optimizing an efficient protocol for the induction of transgenic roots in lentil, thus adding an attractive tool to root biology studies. Finally, General Discussion (Chapter 8) describes the situation regarding lentil cultivation worldwide, specifically in the context of factors limiting the crop’s viability as well as actions required to successfully meet current and future challenges. In this framework, the focus is placed on the perspectives of upgrading breeding procedures through the exploitation of possibilities arising by the use of novel molecular approaches.

Η καλλιέργεια της φακής υπόκειται σε μία πληθώρα βιοτικών και αβιοτικών καταπονήσεων, οι οποίες περιορίζουν την αύξηση και ανάπτυξη και επιφέρουν σημαντικές απώλειες απόδοσης. Στοχεύοντας στην εξασφάλιση της βιωσιμότητας της καλλιέργειας, η χρήση ποικιλιών με γενετική ανθεκτικότητα έναντι καταπονήσεων αποτελεί την πλέον αποτελεσματική, αειφόρο και οικονομική προσέγγιση. Βάσει των δυνητικών επιπτώσεων στην καλλιέργεια, οι περισσότερο επιζήμιες καταπονήσεις είναι η ξηρασία, η υψηλή αλατότητα και η ασθένεια της φουζαρίωσης, που προκαλείται από τον παθογόνο μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. lentis (Fol). Με δεδομένη την έλλειψη ερευνητικών δεδομένων σχετικά με τους μηχανισμούς που ελέγχουν την ανθεκτικότητα έναντι των ανωτέρω καταπονήσεων καθώς και την έλλειψη κατάλληλων μεθόδων επιλογής ανθεκτικών γονοτύπων, η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε αρχικά στην αξιολόγηση γενετικού υλικού φακής ως προς την ανθεκτικότητα έναντι της καταπόνησης που επιφέρει η ξηρασία και η υψηλή αλατότητα καθώς και στην ταυτοποίηση του παθογόνου που προκαλεί την ασθένεια της φουζαρίωσης σε εγχώριες ζώνες καλλιέργειας φακής. Ακολούθως, ως ερευνητικοί στόχοι τέθηκαν η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα έναντι της ξηρασίας και της φουζαρίωσης, μέσω μελέτης της μεταβολικής απόκρισης γενετικού υλικού φακής στις ανωτέρω καταπονήσεις. Τέλος, η έρευνα εστίασε στη δημιουργία ενός αποτελεσματικού πρωτοκόλλου γενετικού μετασχηματισμού της φακής, κατάλληλου προς αξιοποίηση σε μελέτες γονιδιακής έκφρασης. Στα Κεφάλαια 2 και 3 διερευνήθηκε η δυνατότητα αξιολόγησης γενετικού υλικού φακής ως προς την ανθεκτικότητα έναντι των καταπονήσεων ξηρασίας και υψηλής αλατότητας, βάσει του προσδιορισμού του δυναμικού βλάστησης των σπόρων και ανάπτυξης των σποροφύτων υπό συνθήκες καταπόνησης. Τα ευρήματα καταδεικνύουν τις δραστικές επιπτώσεις των ανωτέρω καταπονήσεων στη βλάστηση και ανάπτυξη, με τις επιδράσεις να είναι ανάλογες της έντασης της καταπόνησης, ενώ παράλληλα υπογραμμίζουν τη δυνατότητα αξιοποίησης της συγκεκριμένης μεθόδου για την ανάδειξη της υπάρχουσας γενετικής παραλλακτικότητας σχετικά με την ανθεκτικότητα έναντι της ξηρασίας και της αλατότητας. Στο πλαίσιο αυτό, οι ποικιλίες ¨Ελπίδα¨, ¨Σάμος¨ και ¨Θεσσαλία¨ εμφάνισαν την καλύτερη επίδοση υπό συνθήκες υδατικής καταπόνησης, ενώ η ποικιλία ¨Σάμος¨ αναδείχθηκε ως η πλέον ανθεκτική ποικιλία έναντι της υψηλής αλατότητας. Τα συνολικά αποτελέσματα παρέχουν σημαντικές ενδείξεις σχετικά με την καταλληλόλητα της μεθόδου για διενέργεια πρώιμων επιλογών ανθεκτικών γονοτύπων. Υπό την προϋπόθεση της επιβεβαίωσης της αξιοπιστίας των ευρημάτων μέσω συσχέτισής τους με δεδομένα από πειραματισμό αγρού, η προσέγγιση αυτή αναμένεται να συμβάλλει προς την αναβάθμιση της αποτελεσματικότητας των διαδικασιών που στοχεύουν στη βελτίωση της ανθεκτικότητας της φακής έναντι αβιοτικών καταπονήσεων. Ακολούθως, μελετήθηκε η μεταβολική απόκριση γενετικού υλικού φακής στην υδατική καταπόνηση με στόχο την κατανόηση των βιοχημικών μηχανισμών που διέπουν την ανθεκτικότητα και τον προσδιορισμό πιθανών βιοδεικτών προς ενσωμάτωση σε διαδικασίες έμμεσης επιλογής ανθεκτικών γονοτύπων (Κεφάλαιο 4). Για το σκοπό αυτό, προσδιορίστηκε το μεταβολικό προφίλ 2 ποικιλιών φακής, οι οποίες βάσει της προηγηθείσας αξιολόγησης διαφέρουν ως προς την ανθεκτικότητα στην ξηρασία (Κεφάλαιο 3), υπό συνθήκες υδατικής καταπόνησης. Η ανάλυση κατέδειξε τη σημαντική επίδραση της υδατικής καταπόνησης στο μεταβολισμό της φακής, με τις επιδράσεις της καταπόνησης να υπόκεινται σε σημαντική γονοτυπική εξάρτηση. Πλέον των διαφορών που εντοπίστηκαν σε ένα εύρος μεταβολιτών με διαφορετικές βιολογικές λειτουργίες, σε επίπεδο ποικιλίας, έντασης της καταπόνησης και αλληλεπίδρασής τους, η ανάλυση κατέδειξε τη διαφορική συσσώρευση των συστατικών D-φρουκτόζη, a,a-τρεχαλόζη, μυο-ινοσιτόλη και L-τρυπτοφάνη στην ανθεκτική και ευαίσθητη ποικιλία, παρέχοντας προοπτικές αξιοποίησής τους ως βιοδείκτες για τον εντοπισμό ανθεκτικών γονοτύπων. Δεδομένης της έλλειψης ερευνητικών δεδομένων σχετικά με τα είδη του γένους Fusarium που προσβάλλουν την καλλιέργεια φακής στον ελλαδικό χώρο, αντικείμενο της μελέτης αποτέλεσε η ταυτοποίηση των απομονώσεων του παθογόνου στις κύριες ζώνες καλλιέργειας της φακής (Κεφάλαιο 5). Για το σκοπό αυτό, έγινε συλλογή εδαφικών δειγμάτων από αγρούς, όπου τα φυτά παρουσίαζαν χαρακτηριστικά συμπτώματα της φουζαρίωσης, και ακολούθησε η απομόνωση του Fusarium spp.. Έπειτα από ταυτοποίηση, μέσω μακροσκοπικών και μικροσκοπικών παρατηρήσεων, έγινε μοριακός χαρακτηρισμός των απομονώσεων βάσει in silico ανάλυσης των αλληλουχιών που κωδικοποιούν τα γονίδια TEF-1α, b-tubulin και calmodulin. Αναφορικά με το γονίδιο TEF-1α, η ανάλυση κατέδειξε υψηλή ομολογία με απομονώσεις του Fusarium spp. (99 %), ενώ οι απομονώσεις που προέρχονται από αγρούς της Λευκάδας και της Φλώρινας, όπου η φακή αποτελεί μονοκαλλιέργεια, εμφάνισαν υψηλή ομολογία με το Fol. Η ανάλυση των γονιδίων b-tubulin και calmodulin, ανέδειξε υψηλή ομολογία με απομονώσεις του F. oxysporum, χωρίς ωστόσο να επιτευχθεί ταυτοποίηση του formae specialis (f.sp. lentis). Η προκαταρκτική αυτή μελέτη συνιστά την πρώτη προσπάθεια ταυτοποίησης απομονώσεων του Fusarium spp. σε εγχώριες ζώνες καλλιέργειας της φακής. H ταυτοποιηση του φουζαριου σε ζωνες καλλιέργειας της φακης μπορει να συμβάλλει θετικά προς το σχεδιασμό κατάλληλων σχημάτων για τη βελτίωση της ανθεκτικότητας της φακής στην ασθένεια της φουζαρίωσης. Στοχεύοντας στην ανάπτυξη ποικιλιών με ανθεκτικότητα έναντι της φουζαρίωσης, οι βελτιωτικές διαδικασίες πρόκειται να επωφεληθούν σημαντικά από την απόκτηση μοριακών δεδομένων σχετικά με το βιολογικό σύστημα Fol-φακής. Στο πλαίσιο αυτό, αντικείμενο του Κεφαλαίου 6 αποτέλεσε η συγκριτική αξιολόγηση της μεταβολικής απόκρισης δύο ποικιλιών φακής, που διαφέρουν ως προς την ανθεκτικότητα στην ασθένεια, υπό συνθήκες τεχνητής μόλυνσης με το Fol. Πέραν της κατανόησης των αμυντικών μηχανισμών έναντι της φουζαρίωσης, απώτερο σκοπό αποτέλεσε ο πιθανός εντοπισμός βιοδεικτών για την πρώιμη επιλογή ανθεκτικών γονοτύπων. Η ανάλυση του GC/MS μεταβολικού προφίλ ρίζας και βλαστού επέτρεψε τον προσδιορισμό των συστατικών που εμφάνισαν σημαντική μεταβολή στη συσσώρευσή τους σε επίπεδο ποικιλίας ή/και μεταχείρισης ή/και αλληλεπίδρασής τους. Τα ευρήματα υπογραμμίζουν την ύπαρξη σημαντικών διαφορών στο μεταβολικό περιεχόμενο μεταξύ της ανθεκτικής και ευαίσθητης ποικιλίας καθώς και μεταξύ των Fol-φυτών και των μαρτύρων. Πέραν των μεταβολών που εντοπίστηκαν σε ένα εύρος μεταβολιτών, τα συνολικά αποτελέσματα υποδεικνύουν τη σημαντική συνεισφορά των συστατικών παλατινιτόλη και L-προλίνη 2 στη μεταβολική απόκριση των ριζών και του βλαστού αντίστοιχα, υποδεικνύοντας τη δυνατότητα αξιοποίησής τους ως βιοδείκτες για το χαρακτηρισμό γενετικού υλικού φακής ως προς την ανθεκτικότητα έναντι της φουζαρίωσης. Με δεδομένη τη δυστροπία της φακής ως προς το γενετικό μετασχηματισμό και την αναγέννηση ιστών, η μελέτη επικεντρώθηκε στην ανάπτυξη ενός σύντομου και αποτελεσματικού πρωτοκόλλου μετασχηματισμού της φακής μέσω του φορέα Agrobacterium rhizogenes (Κεφάλαιο 7). Στο πλαίσιο βελτιστοποίησης του πρωτοκόλλου, μελετήθηκε η επίδραση τριών βακτηριακών στελεχών (R1000, K599 και Arqua) καθώς και της σύστασης των θρεπτικών μέσων, αναφορικά με την παρουσία ακετοσιριγκόνης και MES ως μέσα επαγωγής του μετασχηματισμού. Τα ευρήματα υποδεικνύουν τη θετική επίδραση του βακτηριακού στελέχους R1000, σε συνδυασμό με τον εμπλουτισμό των μέσων με ακετοσυριγκόνη/MES, στη συχνότητα του μετασχηματισμού. Η διαγονιδιακή φύση των ριζών επιβεβαιώθηκε μέσω της ένθεσης του γονιδίου rolB2 και της ταυτόχρονης απουσίας της virCD αλληλουχίας του A. rhizogenes. Τα ευρήματα υπογραμμίζουν ότι ο μετασχηματισμός, μέσω του A. rhizogenes, αποτελεί μία εναλλακτική προσέγγιση δημιουργίας διαγονιδιακών ιστών στη φακή, η δυστροπία της οποίας δυσχεραίνει τις προσπάθειες σταθερού μετασχηματισμού και αναγέννησης ολόκληρων φυτών. Η μελέτη αυτή αποτελεί την πρώτη αναφορά σχετικά με την ανάπτυξη ενός αποτελεσματικού πρωτοκόλλου για την επαγωγή διαγονιδιακών ριζών στη φακή, προσθέτοντας ένα ελκυστικό εργαλείο στις έρευνες σχετικά με τη βιολογία ριζών. Τέλος, η Γενική Συζήτηση (Κεφάλαιο 8) πλαισιώνει την υφιστάμενη κατάσταση της καλλιέργειας της φακής σε παγκόσμιο επίπεδο, ιδιαίτερα υπό το πρίσμα των άμεσων και μελλοντικών προκλήσεων και των ενεργειών που στοχεύουν στην επιτυχή αντιμετώπισή τους. Προς την κατεύθυνση αυτή, γίνεται μνεία στις προοπτικές αναβάθμισης των διαδικασιών βελτίωσης της φακής αξιοποιώντας τις δυνατότητες που προσφέρουν οι σύγχρονες μοριακές προσεγγίσεις.