Γενετική κληρονομικού αγγειοοιδήματος

Abstract

Objective: In approximately 9.2% of patients with C1-INH-HAE, no causal variant has been identified by standard mutational screening, which is ordinarily restricted to the coding exons of the SERPING1. This suggests that, in some patients, the causative variant that modifies C1-INH expres-sion may be located in the intronic region of SERPING1. Furthermore, until now four pathogenic var-iants have been identified in exon 9 of F12 and have been associated with FXII-HAE. Of interest is the search for alterations in F12 beyond exon 9. The purpose of this study was (a) to detect pathogenic intronic variants in SERPING1 and (b) to detect new F12 variants that are potentially responsible for the FXII-HAE pathogenesis.Material and Methods: Using NGS platform targeting the entire SERPING1, 15 DNA samples be-longing to C1-INH-HAE patients with no detectable mutations in the coding region of the gene were sequenced. Of the intronic variants identified, those with frequency less than 5% were analyzed us-ing ten bioinformatics tools. Pedigree analysis and examination of their pathogenic effect on the mRNA level were performed for filtered in variants. Furthermore, DNA samples from 197 patients with nC1-INH-HAE, 161 patients with C1-INH-HAE and 46 healthy family members were genotyped by targeted NGS aiming the sequencing of the F12. Sanger sequencing was performed for the verifi-cation of all identified variants and family segregation studies.Results: Of the 37 intronic variants detected in the SERPING1, only three were further examined, c.-22-155G>T, c.890-14C>G and c.1029+384A>G. Bioinformatics tools predicted the variants as patho-genic, while pedigrees analysis showed its co-segregation with the disease. Functional study for the c.-22-155G>T variant showed degradation of the mutant allele. Moreover, six variants were identi-fied in F12, four of which were characterized as benign (c.41T>C, c.418C>G, c.1025C>T, c.530C>T) and two of uncertain significance (c.1530G>C, c.1768T>G). Three synonymous variants (c.756C>T, c.711C>T, c.1599A>G), the common polymorphism c.619G>C and the functional polymorphism c.-4T> C were detected in allele frequencies similar to those presented in the gnomAD database for the European population. Finally, the two published pathogenic variants, c.983C> A and c.892_909dup, were detected.Conclusions: Three intronic variants were detected by NGS in the SERPING1 and were proven as pathogenic and likely pathogenic for C1-INH-HAE. Therefore, advanced DNA sequencing methods should be performed in cases of C1-INH-HAE where standard approaches fail to uncover the genetic alteration. Furthermore, analyzing the entire translated region of F12 is important in order to identi-fy new variants that possibly affect HAE expressivity.

Σκοπός: Σε περίπου 9,2% των ασθενών με κληρονομικό αγγειοοίδημα λόγω ανεπάρκειας του αναστολέα C1 εστεράσης, η παθογόνος μετάλλαξη δεν ανιχνεύεται με την αλληλούχηση των εξωνίων του SERPING1. Συμπεραίνεται ως εκ τούτου ότι η αιτιατή μετάλλαξη μπορεί να εντοπίζεται σε ιντρονική περιοχή του γονιδίου. Επιπλέον, μέχρι σήμερα έχουν ανιχνευτεί τέσσερις παθογονικές μεταλλάξεις στο εξώνιο 9 του F12 και έχουν συσχετιστεί με το FXII-HAE. Ενδιαφέρον παρουσιάζει η αναζήτηση μεταλλάξεων στο F12 πέρα από το εξώνιο 9. Κατόπιν αυτών σκοπός της μελέτης αποτέλεσε (α) η ανίχνευση παθογονικών ιντρονικών μεταλλάξεων στο SERPING1 και (β) η ανίχνευση νέων μεταλλάξεων στο γονίδιο F12 που δυνητικά ευθύνονται για την εμφάνιση του FXII-HAE.Ασθενείς και Μεθοδολογία: Χρησιμοποιώντας την τεχνολογία αλληλούχησης νέας γενεάς, η οποία στοχεύει ολόκληρο το SERPING1, προσδιορίστηκαν οι αλληλουχίες δεκαπέντε ασθενών με C1-INH-HAE χωρίς μεταλλάξεις στις εξωνικές περιοχές του γονιδίου. Από τις ιντρονικές μεταλλάξεις που εντοπίστηκαν μελετήθηκαν αυτές που είχαν συχνότητα μικρότερη από 5% και εξετάστηκαν με τη χρήση δέκα βιοπληροφορικών εργαλείων. Για τις φιλτραρισμένες μεταλλάξεις πραγματοποιήθηκαν οικογενειακές και λειτουργικές μελέτες στο επίπεδο του mRNA. Με στόχο την αλληλούχηση του γονιδίου F12, γονοτυπήθηκαν με τη πλατφόρμα NGS 197 ασθενείς με nC1-INH-HAE, 161 ασθενείς με C1-INH-HAE και 46 υγιή μέλη των οικογενειών τους. Η επαλήθευση των ανιχνευμένων μεταλλάξεων και οι οικογενειακές μελέτες πραγματοποιήθηκαν με αλληλούχηση κατά Sanger.Αποτελέσματα: Από τις 37 ιντρονικές μεταλλάξεις που ανιχνεύτηκαν στο γονίδιο SERPING1, διερευνήθηκαν περαιτέρω τρεις μεταλλάξεις, c.-22-155G>T, c.890-14C>G, c.1029+384A>G. Τα βιοπληροφορικά εργαλεία χαρακτήρισαν τις μεταλλάξεις ως παθογονικές, ενώ οι οικογενειακές μελέτες έδειξαν ότι οι μεταλλάξεις ανιχνεύονται μόνο στα ασθενή μέλη της εκάστοτε οικογένειας. Η λειτουργική μελέτη για τη μετάλλαξη c.-22-155G>T έδειξε αποικοδόμηση του μεταλλαγμένου αλληλομόρφου. Επιπλέον, στο F12 εντοπίστηκαν έξι μεταλλάξεις, τέσσερις από τις οποίες χαρακτηρίστηκαν ως καλοήθεις (c.41T>C, c.418C>G, c.1025C>T, c.530C>T) και δύο μεταλλάξεις άγνωστης παθογονικότητας (c.1530G>C, c.1768T>G). Τρεις συνώνυμες μεταλλάξεις (c.756C>T, c.711C>T, c.1599A>G), ο κοινός πολυμορφισμός c.619G>C και ο λειτουργικός πολυμορφισμός c.-4T>C ανιχνεύθηκαν σε συχνότητες αλληλομόρφων παρόμοιες με αυτές που παρουσιάζονται στη βάση gnomAD για τον ευρωπαϊκό πληθυσμό. Τέλος, ανιχνεύτηκαν οι δύο δημοσιευμένες παθογονικές μεταλλάξεις c.983C>A και c.892_909dup. Συμπεράσματα: Τρεις από τις 37 ιντρονικές μεταλλάξεις στο SERPING1 χαρακτηρίστηκαν ως παθογονικές και πιθανώς παθογονικές για το C1-INH-HAE. Επομένως, η χρήση της τεχνολογίας αλληλούχησης νέας γενεάς θα πρέπει να χρησιμοποιείται σε περιπτώσεις C1-INH-HAE, όπου οι τυπικές προσεγγίσεις αποτυγχάνουν να αποκαλύψουν τη αιτιατή μετάλλαξη. Επιπλέον, η ανάλυση ολόκληρης της μεταφραζόμενης περιοχής του F12 είναι σημαντική για την ανίχνευση νέων μεταλλάξεων που πιθανώς οδηγούν στην εμφάνιση του FXII-HAE.