Βιοχημικές και βιοφυσικές μελέτες πρωτεϊνικών μορίων που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό σύστημα

Abstract

Major histocompatibility complex class I (MHC I) is a transmembrane heterodimeric protein complex, which is expressed in every nucleated cell and presents antigenic peptides (usually 8-10 residues in length) to CD8+ T-cytotoxic lymphocytes, thus playing important roles in adaptive immune responses. N-terminally extended antigenic peptide precursors enter the endoplasmic reticulum (ER), where they are proteolytically processed by endoplasmic reticulum aminopeptidase 1 (ERAP1) and subsequently bind onto MHC I protein molecules. ERAP1 helps to define antigenic peptide production, indirectly regulates adaptive immune responses and therefore constitutes an attractive pharmacological target for cancer immunotherapy and the treatment of autoimmunity. However, the exact mechanism that allows ERAP1 to efficiently process a vast variety of antigenic peptide precursors is not fully understood. Recent studies have suggested that ERAP1 can catabolize antigenic peptides both when they are free in solution and when they are bound onto MHC I complexes. Those 2 mechanisms are fundamentally different in terms of how peptides are selected and it remains unclear which mechanism is dominant. This question was addressed in the present thesis as follows: a) formation of MHC I complexes was performed in vitro with selected peptides of different sizes, b) the thermodynamic and kinetic stability of the complexes was studied by using biochemical and biophysical methods and c) ERAP1 enzymatic activity was assessed towards the catabolism of peptides free in solution and bound onto preformed MHC I complexes. In every case studied the enzyme was highly effective in catabolizing free peptides in solution. On the contrary, peptides which are bound onto MHC I complexes are either fully protected from enzyme activity or their apparent catabolism occurs due to rapid dissociation from the complex and subsequent trimming in solution. In conclusion, the results presented in this thesis suggest that solution trimming is the main mechanism by which ERAP1 generates antigenic peptides. Consequently, the selection of antigenic peptides depends on direct interactions between the enzyme and peptide substrates prior to binding onto MHC I.

Το μείζον σύμπλοκο ιστοσυμβατότητας τάξης 1 (MHC I) αποτελεί ένα διαμεμβρανικό ετεροδιμερές πρωτεϊνικό σύμπλοκο, το οποίο εκφράζεται σε όλα τα εμπύρηνα κύτταρα και παρουσιάζει αντιγονικά πεπτίδια (συνήθως μήκους 8-10 αμινοξέων) στα CD8+ Τ-κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα διαδραματίζοντας κομβικό ρόλο στην επίκτητη ανοσολογική απόκριση. Αμινοτελικά εκτεταμένοι πρόδρομοι αντιγονικοί επίτοποι εισέρχονται στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER), όπου υφίστανται επεξεργασία από την αμινοπεπτιδάση 1 του ενδοπλασματικού δικτύου (ΕRAP1) ώστε να μετατραπούν σε ώριμους επιτόπους και ύστερα να δεσμευτούν στα μόρια MHC I. Η ERAP1 καθορίζει την παραγωγή αντιγονικών πεπτιδίων, παίζει κομβικό ρόλο στη ρύθμιση της επίκτητης ανοσολογικής απόκρισης και αποτελεί ελκυστικό αναδυόμενο στόχο για την ανοσοθεραπεία του καρκίνου και τη ρύθμιση της αυτοανοσίας. Ωστόσο τα κριτήρια επιλογής βάσει των οποίων η ERAP1 επεξεργάζεται αποτελεσματικά ένα τεράστιο αριθμό πρόδρομων αντιγονικών πεπτιδίων δεν είναι πλήρως κατανοητά. Πρόσφατες μελέτες έχουν προτείνει ότι η ERAP1 μπορεί να καταβολίσει αντιγονικά πεπτίδια τόσο όταν τα τελευταία βρίσκονται ελεύθερα στο διάλυμα όσο και όταν είναι προσδεμένα στα μόρια MHC I. Αν και οι δύο αυτοί μηχανισμοί έχουν βασικές διαφορές στο πως επιλέγουν πεπτίδια, δεν είναι ξεκάθαρο ακόμα ποιος μηχανισμός είναι κυρίαρχος. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή προσεγγίστηκε το ανωτέρω ερώτημα ως εξής: α) πραγματοποιήθηκε σχηματισμός in vitro συμπλόκων MHC I με επιλεγμένα πεπτίδια διαφορετικού μεγέθους, β) μελετήθηκε η θερμοδυναμική και κινητική σταθερότητα των συμπλόκων με βιοφυσικές και βιοχημικές μεθόδους και γ) μελετήθηκε ενζυμικά η δράση της ERAP1 ως προς τον καταβολισμό πεπτιδίων ελεύθερων στο διάλυμα και στα προσχηματισμένα σύμπλοκα MHC I. Σε όλες τις περιπτώσεις, διαπιστώθηκε ότι υπόστρωμα του ενζύμου αποτελούν τα πεπτίδια που βρίσκονται ελεύθερα στο διάλυμα. Αντίθετα, τα πεπτίδια που βρίσκονται δεσμευμένα στα σύμπλοκα MHCI είτε προστατεύονται πλήρως από την ενζυ μική δράση είτε ο φαινομενικός καταβολισμός τους οφείλεται σε ταχεία αποδέσμευση από το σύμπλοκο και ακολούθως καταβολισμό στο διάλυμα. Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα αυτά ξεκάθαρα στηρίζουν τον μηχανισμό κατά τον οποίο η ERAP1 καταβολίζει πεπτίδια που είναι ελεύθερα στο διάλυμα και ως αποτέλεσμα η επιλογή αντιγονικών πεπτιδίων βασίζεται στην απ’ ευθείας αλληλεπίδραση του ενζύμου με ελεύθερα πεπτίδια πριν τη δέσμευση στα MHC I.