Μοριακοί μηχανισμοί κυτταρικού επαναπρογραμματισμού

Abstract

The present doctoral dissertation studies the mechanisms regulating the inducible gene expression of eukaryotic cells at whole genome level and more specifically, the identification of molecular switches, which based on the coordinated cells response, they control the function of enhancers in different cell types before and after virus infection. The characterization of enhancers that respond to viral infections in the human genome is required in order to understand the coordination of the immune response and the molecular characteristics that range from the binding of transcription factors, co-activators, modifiers, and chromatin remodellers to transcription activation. Our research was based on a pioneering and holistic approach of the phenomenon of virus infection, the application of which combines all the data derived from a variety of genomic techniques. More than 150 analyses of RNA-seq, ChIP-seq, DNaseI-seq, FAIRE-seq, STARR-seq methods and multi-level bioinformatics analyses were performed, which have as a common method of analysis the Next Generation Sequencing (NGS) technology. In order to compare the difference expression regulatory programs during virus infection, our study was performed on different cell types, at HeLa epithelial cells and Namalwa B-lymphocytes, which were transfected with Sendai virus as an environmental stimulus. Chromatin characteristics, epigenomic profiling, as well as transcription machinery involvement in genomic coordinates, where enhancers are located and a large number of well-characterized anti-viral genes, led us to the construction of a "molecular-digital encyclopedia" of genes and enhancers. The encyclopedia is characterized and can reveal a high potential for anti-viral properties and markers, and is called Human-ATLAS-of-Virus-Infection. The finding of Human-ATLAS were further validated by applying the ChIP-STARR-seq method. This innovative, large-scale method allow us to simultaneously examine the virus inducible activity of the numerous binding sites of IRF3 and p65, the transcriptional regulators of the anti-viral response. Sequence-based analyses have revealed that functional anti-viral enhancers containing IRF motifs are highly conservative throughout evolution, as they are found in the genomes of different species representing vertebrates, invertebrates, plants, and even microbes. These repeat sequences are the first examples of repeating sequences with primary origin for anti-viral response regulation. In order to systematically study the function of the conserved sequences from the above different organisms in human cells, and also in order to determine whether these sequences also show conserved enhancer activity, we cloned them into STARR vectors. HeLa cells were transfected and we monitored their ability to activate the expression of the GFP reported gene in vivo. This is one of the few times that enhancers are conserved in different phyla, and primordial sequences appear to function as the regulators of inducible gene expression during the anti-viral cellular response.Based on the above, the completion of this dissertation leads to a detailed observation of the mechanism used by human cells to respond during viral infections. It also lays the groundwork for further investigation as well as for the discovery of unknown elements that participate in this process. Decoding the regulatory logic behind genome remodeling after viral infection will lead to a deeper understanding of the basic principles of genome organization and the ability to predict patients' response to treatment and prevention with the ultimate goal of being applied on an individual basis.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή μελετά τους μηχανισμούς ρύθμισης της επαγόμενης γονιδιακής έκφρασης ευκαρυωτικών κυττάρων σε επίπεδο ολόκληρου του γονιδιώματος και πιο συγκεκριμένα, την ταυτοποίηση των μοριακών διακοπτών, οι οποίοι βάση της συντονισμένης απόκρισης των κυττάρων, ελέγχουν τη λειτουργία των ενισχυτών σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους πριν και μετά από ιϊκή μόλυνση. O χαρακτηρισμός των ενισχυτών που αποκρίνονται σε ιϊκές μολύνσεις στο ανθρώπινο γονιδίωμα απαιτείται για την κατανόηση του συντονισμού της ανοσολογικής απόκρισης και των μοριακών χαρακτηριστικών που κυμαίνονται από την πρόσδεση μεταγραφικών παραγόντων, συνενεργοποιητών, τροποποιητών και αναδιαμορφωτών της χρωματίνης μέχρι την ενεργοποίηση της μεταγραφής γονιδίων.Η έρευνά μας συνίσταται από μια πρωτοποριακή και ολιστική προσέγγιση του φαινομένου των ιϊκών μολύνσεων, η εφαρμογή της οποίας συνδυάζει όλα τα δεδομένα που προέρχονται από μια πληθώρα τεχνικών της γονιδιωματικής. Χρησιμοποιήθηκαν περισσότερες από 150 αναλύσεις των μεθόδων RNA-seq, ChIP-seq, DNaseI-seq, FAIRE-seq, STARR-seq και πολυεπίπεδων βιοπληροφορικών αναλύσεων, τα οποία έχουν ως κοινή μέθοδο ανάλυσης την τεχνολογία αλληλούχησης ευρείας κλίμακας νέας γενιάς (Next Generation Sequencing, NGS). Η σύγκριση των ρυθμιστικών προγραμμάτων γονιδιακής έκφρασης στη διάρκεια της μόλυνσης πραγματοποιήθηκε σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους, στα επιθηλιακά κύτταρα HeLa και στα Β-λεμφοκύτταρα Namalwa, τα οποία διαμολύνθηκαν με ιό Sendai, ως περιβαλλοντικό ερέθισμα. Τα χαρακτηριστικά της χρωματίνης, το προφίλ του επιγονιδιώματος καθώς και η συμμετοχή της μεταγραφικής μηχανής σε γονιδιωματικές συντεταγμένες, όπου εδράζονται οι ενισχυτές και ένας μεγάλος αριθμός καλά χαρακτηρισμένων αντι-ιϊκών γονιδίων, έθεσαν τις βάσεις για την κατασκευή μιας "μοριακής-ψηφιακής εγκυκλοπαίδειας" των γονιδίων και των ενισχυτών. Η εγκυκλοπαίδεια χαρακτηρίζεται με υψηλή εν δυνάμει πιθανότητα να παρουσιάσει "αντι-ιϊκές ιδιότητες" και ονομάζεται ΆΤΛΑΝΤΑΣ των ιϊκών μολύνσεων (Human-ATLAS-of-Virus-Infection). Ο ΑΤΛΑΝΤΑΣ επικυρώθηκε με την εφαρμογή της μεθόδου ChIP-STARR-seq. Η πρωτοποριακή αυτή μέθοδος ευρείας κλίμακας μας επέτρεψε την ταυτόχρονη εξέταση της ιϊκά επαγόμενης ενεργότητας των πολυάριθμων περιοχών πρόσδεσης των μεταγραφικών ρυθμιστών της αντι-ιϊκής απόκρισης IRF3 και p65. Αναλύσεις βασισμένες στη συντήρηση των αλληλουχιών αποκάλυψαν ότι οι λειτουργικοί αντι-ιϊκοί ενισχυτές που περιέχουν συμπλέγματα IRF μοτίβων είναι σε μεγάλο βαθμό σταθεροί σε όλη την εξέλιξη καθώς βρίσκονται στα γονιδιώματα διαφορετικών ειδών που αντιπροσωπεύουν τα σπονδυλωτά, τα ασπόνδυλα, τα φυτά, ακόμη και μικρόβια, συμπεριλαμβανομένων των ιϊκών στελεχών. Αυτές οι απλές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες αποτελούν τα πρώτα παραδείγματα επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών με αρχέγονη προέλευση ρύθμισης της αντι-ιϊκής απόκρισης. Προκειμένου να μελετηθεί συστηματικά η λειτουργία των συντηρημένων αλληλουχιών από τους παραπάνω διαφορετικούς οργανισμούς σε ανθρώπινα κύτταρα, αλλά και να διαπιστωθεί αν αυτές οι αλληλουχίες παρουσιάζουν και συντηρημένη ενεργότητα ενισχυτών, προβήκαμε σε κλωνοποίηση σε φορείς STARR. Έγινε διαμόλυνση σε κύτταρα HeLa και παρακολουθήσαμε την ικανότητά τους να ενεργοποιούν την έκφραση του γονίδιο αναφοράς GFP in νίνο. Αυτή είναι μία από τις λίγες φορές που οι ενισχυτές διατηρούνται συντηρημένοι σε διαφορετικά Φύλα και οι αλληλουχίες με την αρχέγονη προέλευση φαίνεται να λειτουργούν ως ρυθμιστές της ανθρώπινης επαγώγιμης γονιδιακής έκφρασης κατά την αντι-ιϊκή κυτταρική απόκριση. Με βάση όλα τα παραπάνω η ολοκλήρωση της διδακτορικής αυτής διατριβής οδηγεί στη λεπτομερέστερη παρατήρηση του μηχανισμού που χρησιμοποιούν τα ανθρώπινα κύτταρα για να αποκριθούν στη διάρκεια των ιϊκών μολύνσεων. Θέτει επίσης τις βάσεις για περαιτέρω διερεύνηση τους καθώς και στην ανακάλυψη άγνωστων ως σήμερα στοιχείων αυτής της διαδικασίας. Η αποκωδικοποίηση της ρυθμιστικής λογικής πίσω από την αναδιαμόρφωση του γονιδιώματος μετά από ιϊκή μόλυνση θα οδηγήσει σε βαθύτερη κατανόηση των βασικών αρχών οργάνωσης του γονιδιώματος και στη δυνατότητα πρόβλεψης της απόκρισης των ασθενών σε θεραπευτικές και προληπτικές αγωγές με απώτερο σκοπό στο μέλλον να εφαρμόζονται σε εξατομικευμένη βάση.