Ανάπτυξη ενός μοντέλου για την μελέτη της επίδρασης της έλλειψης της ενδογενούς παραγωγής υδρόθειου στην ανθεκτικότητα πολυανθεκτικών μικροοργανισμών (Pseudomonas aeruginosa & Klebsiella pneumoniae) ενάντια στην αντιμικροβιακή αγωγή

Abstract

Hydrogen sulfide (H2S) has recently been recognized as a novel gaseous transmitterwith several anti-inflammatory properties. The role of host- derived H2S in infectionsby Pseudomonas aeruginosa was investigated in clinical and mouse models. H2Sconcentrations and survival was assessed in septic patients with lung infection. Animalexperiments using a model of severe systemic multidrug-resistant P. aeruginosainfection were performed using mice with a constitutive knock-out of cystathionine-γlyase (Cse) gene (Cse-/-) and wild-type mice with a physiological expression (Cse+/+).Experiments were repeated in mice after a) treatment with cyclophosphamide; b) bonemarrow transplantation (BMT) from a Cse+/+ donor; c) treatment with H2S synthesisinhibitor aminooxyacetic acid (ΑΟΑΑ) or propargylglycine (PAG) and d) H2S donorsodium thiosulfate (STS) or GYY3147. Bacterial loads and myeloperoxidase activitywere measured in tissue samples. The expression of quorum sensing genes (QS) wasdetermined in vivo and in vitro. Cytokine concentration was measured in serum andincubated splenocytes. Patients survivors at day 28 had significantly higher serum H2Scompared to non-survivors. A cut- off point of 5.3 μΜ discriminated survivors withsensitivity 92.3%. Mortality after 28 days was 30.9% and 93.7% in patients with H2Shigher and less than 5.3 μΜ (p= 7 x 10-6). In mice expression of Cse and applicationof STS afforded protection against infection with multidrug-resistant P. aeruginosa.Cyclophosphamide pretreatment eliminated the survival benefit of Cse+/+ mice,whereas BMT increased the survival of Cse-/- mice. Cse-/- mice had increasedpathogen loads compared to Cse+/+ mice. Phagocytic activity of leukocytes from Cse-/- mice was reduced but was restored after H2S supplementation. An H2S dependentdown- regulation of quorum sensing genes of P.aeruginosa could be demonstrated invivo and in vitro. Endogenous H2S is a potential independent parameter correlatingwith the outcome of P. aeruginosa. H2S provides resistance to infection by MDRbacterial pathogens.

Το υδρόθειο (H2S) έχει πρόσφατα αναγνωριστεί ως ένας νέος αέριος διαβιβαστής μεαντιφλεγμονώδεις δράσεις. Ο ρόλος του παραγόμενου από τον ξενιστή H2S σελοιμώξεις από αεριογόνο ψευδομονάδα Pseudomonas (P.) aeruginosa διερευνήθηκεσε ένα κλινικό και ζωικό μοντέλο. Μελετήθηκαν οι συγκεντρώσεις του H2S και ηεπιβίωση σηπτικών ασθενών με λοιμώξεις του κατώτερου αναπνευστικού. Στησυνέχεια αναπτύχθηκε ένα ζωικό μοντέλο σοβαρής συστηματικής λοίμωξης απόπολυανθεκτική P. aeruginosa iχρησιμοποιώντας μύες με έλλειψη του γονιδίου της γ-λυάσης της κυσταθειονίνης (Cse) (Cse-/- μύες) και μύες με φυσιολογική έκφραση τουγονιδίου (Cse+/+ μύες). Πειράματα επαναλήφθηκαν σε μύες μετά από α) θεραπεία μεκυκλοφωσφαμίδη, β) μεταμόσχευση μυελού των οστών από δότη Cse+/+, γ) θεραπείαμε τους αναστολείς της σύνθεσης H2S αμινοοξεϊκό οξύ (aminooxyacetic acid, ΑΟΑΑ)ή προπαργυλγλυκίνη (propargylglycine, PAG) και δ) τους δότες H2S θειοθειικό νάτριο(sodium thiosulfate, STS) ή το GYY3147. Το μικροβιακό φορτίο και ημυελουπεροξειδάση προσδιορίστηκαν σε δείγματα ιστών. Η έκφραση του τωνγόνιδίων του συτήματος quorum sensing (QS) της ψευδομονάδας προσδιορίσθηκε invivo και in vitro. Μετρήθηκαν οι συγκεντρώσεις κυτταροκινών στον ορό και διεγερμένασπληνοκύτταρα. Οι ασθενείς που επιβίωσαν 28 ημέρες μετά τη λοίμωξη είχανσημαντικά υψηλότερα επίπεδα H2S ορού σε σύγκριση με ασθενείς που δεν επιβίωσαν.Επίπεδα H2S ορού 5.3 μΜ διαχωρίζουν τους επιβιώσαντες με ευαισθησία 92.3%. Ηθνητότητα στις 28 ημέρες ήταν 30.9% και 93.7% σε ασθενείς με επίπεδα H2Sυψηλότερα ή χαμηλότερα από 5.3 μΜ αντίστοιχα (p= 7 x 10-6). Η φυσιολογική έκφρασητου Cse καθώς και η θεραπεία με δότη H2S δρα προστατευτικά ενάντια σε λοίμωξη μεπολυανθεκτική P. aeruginosa. Η προθεραπεία με κυκλοφωσφαμίδη εξάλειψε τοπλεονέκτημα επιβίωσης των Cse+/+ μυών, ενώ η μεταμόσχευση μυελού των οστώναύξησε την επιβίωση των Cse-/- μυών. Οι Cse-/- μύες εμφάνισαν αυξημένα μικροβιακάφορτία σε σύγκριση με τους Cse+/+ μύες. Η φαγοκυτταρική δράση των λευκοκυττάρωντων Cse-/- μυών ήταν μειωμένη ενώ αποκαταστάθηκε μετά από προσθήκη H2S. Μίασχετιζόμενη με το H2S μείωση της έκφρασης των γονιδίων του QS P.aeruginosaαναδείχθηκε in vivo και in vitro. Η ενδογενής παραγωγή H2S είναι ένας πιθανόςανεξάρτητος προστατευτικός παράγοντας για την έκβαση λοίμωξης από P.aeruginosa. Το H2S παρέχει προστασία ενάντια σε πολυανθεκτικά βακτηριακάπαθογόνα.