Υποδοχέας της φωσφολιπάσης Α2 και συσχέτισή του με την κλινική πορεία ασθενών με ιδιοπαθή μεμβρανώδη σπειραματονεφρίτιδα

Abstract

Primary membranous nephropathy (MN) is the prototype of immune-mediated glomerular disease and one of the most common causes of nephrotic syndrome and chronic kidney disease worldwide. Its pathogenesis involves appearance of autoantibodies against certain glomerular membrane antigens, formation of antigenantibody complexes and subsequent deposition of these immune complexes in the membrane subepithelial surface. Research for the target antigen in human MN led to the discovery of autoantibodies against a podocyte protein which was identified as the M type phospholipase A2 receptor. The present work represents the first formal study of anti-PLA2R autoantibodies in Greek patients with MN. Our primary goals were the detection of anti-PLA2R antibodies in the serum of patients with diagnosed MN, the evaluation of parameters that could be associated with their appearance, as well as quantitative measurement and monitoring of their level alterations. The study included 65 patients who were diagnosed and treated at two distinguished nephrological centers, the Nephrology Department of the University Hospital of Patras and the Nephrology Department of the University Hospital of Thessaloniki. Measurement of antiPLA2R antibodies was carried out with a widely-used commercially available ELISA kit and the positivity threshold was defined as 20 RU/ml. According to our results, detectable or positive anti-PLA2R antibodies were found in 16 of 33 patients at the time of diagnosis (48.5%). Patients with positive anti-PLA2R antibodies were mostly women. Comparison between PLA2R-positive and negative patients at diagnosis did not reveal any differences in their demographic, clinical or histological characteristics. Baseline anti-PLA2R levels were correlated with patient outcome after immunosuppressive treatment and anti-PLA2R titer was identified as the only independent factor associated with the achievement of partial compared to complete remission (p=0.02). Furthermore, anti-PLA2R levels were positively correlated with proteinuria levels at the end of a 5-year follow up (p=0.0002). Ιn the subgroup of PLA2R-positive patients at diagnosis, higher antibody levels were significantly correlated with greater proteinuria (p=0.0001) and lower eGFR (p=0.0083) after 5 years of follow-up. These associations remained significant when the positivity threshold was set to a lower level of 2 RU/ml (p<0.0001 and p=0,0111, respectively) corresponding to higher sensitivity of the test. In 17 patients, we measured anti-PLA2R levels at random time points during their routine visits, after diagnosis and treatment initiation. At the time the blood samples were taken, the majority of patients were at complete (53%) or partial remission (23.5%) of proteinuria and they all had normal kidney function. Antibody levels ranged from 0 to 5043 RU/ml and only 23.5% were found positive. No correlation was reported between antibody positivity or titer and patient characteristics and longterm outcomes. In a different group of 14 patients, anti-PLA2R antibodies were measured in two blood samples that had been obtained at two distinct time points during their follow up. Depending on their clinical status in the corresponding time, all patients were classified in 3 groups; group A included 4 patients with nephrotic syndrome who achieved complete remission after immunosuppressive treatment; group B consisted of 5 patients with prolonged clinical remission; and in group C, antibodies were measured during clinical remission and a relapse episode in 6 patients. Despite the small number of patients, the differences between the 3 groups were profound. More specifically, antibody level alterations were considered significant in groups A and C, in which there was a change of clinical status (p=0.0448 and p=0.0379, respectively). On the contrary, titer alteration was not significant in patients with sustained remission included in group B (p=0.3781).Our main conclusions are in agreement with results of similar studies in various populations. Baseline anti-PLA2R levels are considered to have a prognostic value, as they are associated with achievement of complete remission. Moreover, they are associated with long-term disease outcome expressed as proteinuria. In the subgroup of PLA2R-positive patients, increased baseline titers have an additional strong correlation with heavier proteinuria and lower eGFR after 5 years of follow-up. Finally, repeated anti-PLA2R measurements confirm the significant correlation of antibody titers with disease clinical activity.

Η πρωτοπαθής μεμβρανώδης νεφροπάθεια (ΜΝ) αποτελεί το πρότυπο σπειραματικής νόσου ανοσολογικής αρχής και ένα από τα συχνότερα αίτιανεφρωσικού συνδρόμου και χρόνιας νεφρικής νόσου στους ενήλικες παγκοσμίως. Η παθογένεια της ΜΝ περιλαμβάνει την εμφάνιση αυτοαντισωμάτων εναντίον συστατικών της βασικής μεμβράνης του νεφρικού σπειράματος, το σχηματισμό ανοσοσυμπλεγμάτων και την εναπόθεσή τους στην υποεπιθηλιακή επιφάνεια της μεμβράνης. Η αναζήτηση για το υπεύθυνο αντιγόνο-στόχο της ΜΝ στον άνθρωπο οδήγησε το 2009 στην ανίχνευση αυτοαντισωμάτων τα οποία αντιδρούν με μια συγκεκριμένη ποδοκυτταρική πρωτεΐνη, η οποία ταυτοποιήθηκε ως ο υποδοχέας τύπου Μ της φωσφολιπάσης Α2 (phospholipase A2 receptor, PLA2R). Η παρούσα διατριβή αποτελεί την πρώτη επίσημη διερεύνηση της παρουσίας των αντι-PLA2R αντισωμάτων στους Έλληνες ασθενείς με ΜΝ. Οι στόχοι της μελέτης μας ήταν η ανίχνευση των αντι-PLA2R αντισωμάτων στον ορό ασθενών με διαγνωσμένη ΜΝ, η αξιολόγηση των παραμέτρων που σχετίζονται με την εμφάνισή τους, καθώς και η ποσοτικοποίηση και παρακολούθηση των επιπέδων τους κατά τη διάγνωση και την κλινική πορεία της νόσου. Στη μελέτη συμμετείχαν 65 ασθενείς οι οποίοι παρακολουθούνται στα ιατρεία σπειραματονεφριτίδων δύο νεφρολογικών κέντρων, του Νεφρολογικού Τμήματος του Πανεπιστημιακού Περιφερειακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών και του Νεφρολογικού Τμήματος του Ιπποκρατείου ΓενικούΝοσοκομείου Θεσσαλονίκης. Ο προσδιορισμός των αντι-PLA2R αντισωμάτων πραγματοποιήθηκε με την ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA, για την οποία χρησιμοποιήθηκε έτοιμο εμπορικό αντιδραστήριο ευρείας κυκλοφορίας, ενώ ως όριο θετικότητας για την ανίχνευση των αντι-PLA2R αντισωμάτων ορίστηκε η τιμή 20 RU/mL. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μελέτης μας, παρουσία ανιχνεύσιμων ή θετικών αντι-PLA2R αντισωμάτων διαπιστώθηκε σε 16 από 33 ασθενείς κατά τη διάγνωση της ΜΝ (ποσοστό 48,5%). Οι ασθενείς με θετικά αντι-PLA2R αντισώματα ήταν στην πλειοψηφία γυναίκες, ενώ δεν παρουσίαζαν διαφορές ως προς τα δημογραφικά χαρακτηριστικά από τους PLA2R-αρνητικούς ασθενείς. Δεν διαπιστώθηκε συσχέτιση της παρουσίας θετικών αντι-PLA2R αντισωμάτων με τα κλινικά και ιστολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών κατά τη διάγνωση της νόσου. Στη συνέχεια μελετήθηκε η έκβαση των ασθενών μετά τη χορήγηση θεραπείας και διαπιστώθηκε ότι ο τίτλος των αντι-PLA2R αντισωμάτων κατά τη διάγνωση αποτελεί τον αποκλειστικό ανεξάρτητο παράγοντα που σχετίζεται με την επίτευξη μερικής έναντι πλήρους ύφεσης μετά τη θεραπεία (p=0,02). Επιπλέον, η μελέτη της μακροχρόνιας έκβασης των ασθενών, μετά από χρονικό διάστημα παρακολούθησης σχεδόν 5 ετών, ανέδειξε ισχυρή θετική συσχέτιση ανάμεσα στον τίτλο αντι-PLA2R και την πρωτεϊνουρία στο τέλος της παρακολούθησης (p=0,0002). Όταν μελετήθηκαν μεμονωμένα οι PLA2R-θετικοί ασθενείς, διαπιστώθηκε ότι τα υψηλότερα επίπεδα αντισωμάτων σχετίζονται σημαντικά τόσο με βαρύτερη πρωτεϊνουρία (p=0,0001) όσο και με χαμηλότερο eGFR (p=0,0083) μετά από μακροχρόνια παρακολούθηση. Μάλιστα, η ισχυρή συσχέτιση με την πρωτεϊνουρία και με τη νεφρική λειτουργία διατηρήθηκε όταν ως όριο θετικότητας επιλέχθηκε η χαμηλότερη τιμή 2 RU/mL (p<0,0001 και p=0,0111, αντίστοιχα), δηλαδή η υψηλότερη ευαισθησία ανίχνευσης των αντι-PLA2R αντισωμάτων. Στη συνέχεια προσδιορίστηκε ο τίτλος αντι-PLA2R αντισωμάτων σε 17 ασθενείς σε μια τυχαία χρονική στιγμή κατά τη διάρκεια της τακτικής τους επίσκεψης, μετά τη διάγνωση και τη χορήγηση θεραπείας. Τη στιγμή της δειγματοληψίας, η πλειοψηφία των ασθενών παρουσίαζαν πλήρη (53%) ή μερική (23,5%) ύφεση της πρωτεϊνουρίας και όλοι είχαν φυσιολογική νεφρική λειτουργία. Η μελέτη των αντισωμάτων έδειξε ότι οι τίτλοι είχαν ευρεία διακύμανση μεταξύ 0-50,43 RU/mL, με ποσοστό θετικών αντισωμάτων μόλις 23,5%. Δεν διαπιστώθηκε καμία συσχέτιση ανάμεσα στη θετικότητα ή τα επίπεδα αντισωμάτων και στα κλινικά χαρακτηριστικά ή τις εκβάσεις των ασθενών. Τέλος, σε 14 ασθενείς μετρήθηκαν αντι-PLA2R αντισώματα σε δύο δείγματα αίματος, τα οποία ελήφθησαν με μεγάλη χρονική απόσταση μεταξύ τους κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης των ασθενών. Με βάση την κλινική εικόνα των ασθενών κατά τη λήψη κάθε δείγματος αίματος, οι ασθενείς ταξινομήθηκαν σε τρεις ομάδες: στην ομάδα Α, στην οποία ανήκαν 4 ασθενείς με νεφρωσικό σύνδρομο που εμφάνισαν πλήρη ύφεση μετά τη λήψη αγωγής, στην ομάδα Β, στην οποία 5 ασθενείς βρίσκονταν σε παρατεταμένη κλινική ύφεση μεταξύ των δύο μετρήσεων, και στην ομάδα Γ, στην οποία σε 6 ασθενείς μετρήθηκαν αντισώματα κατά τη διάρκεια ύφεσης και ενός επεισοδίου υποτροπής. Παρά το μικρό αριθμό ασθενών, οι διαφορές μεταξύ των τριών ομάδων είναι χαρακτηριστικές. Συγκεκριμένα, στις ομάδες Α και Γ, στις οποίες υπήρξε μεταβολή της κλινικής κατάστασης, οι μεταβολές των επιπέδων αντι- PLA2R αντισωμάτων βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές (ομάδα Α, p=0,0448 και ομάδα Γ, p=0,0379). Αντίθετα στην δεύτερη ομάδα της παρατεταμένης ύφεσης, οι μεταβολές των επιπέδων δεν ήταν στατιστικά σημαντικές (p=0,3781). Τα κύρια συμπεράσματα της μελέτης μας βρίσκονται σε γενική συμφωνία με αντίστοιχα συμπεράσματα μελετών σε ποικίλους γεωγραφικούς πληθυσμούς. Αναλυτικότερα, τα αρχικά επίπεδα των αντι-PLA2R αντισωμάτων κατά τη διάγνωση είχαν σημαντική προγνωστική αξία, καθώς συσχετίστηκαν σημαντικά με την επίτευξη πλήρους ή μερικής ύφεσης. Στο σύνολο των ασθενών υπήρξε σημαντική συσχέτιση των επιπέδων αντι-PLA2R αντισωμάτων με τη μακροχρόνια κλινική έκβαση της νόσου, η οποία εκφράζεται ως πρωτεϊνουρία. Στην υποομάδα των PLA2R-θετικών ασθενών διαπιστώθηκε ισχυρή συσχέτιση των υψηλών τίτλων αντισωμάτων με βαρύτερη πρωτεϊνουρία και μειωμένη νεφρική λειτουργία μετά από 5 χρόνια παρακολούθησης. Τέλος, στους ασθενείς μας επιβεβαιώθηκε η στενή σχέση των επιπέδων αντι-PLA2R αντισωμάτων με την κλινική ενεργότητα της νόσου, μέσα από επαναλαμβανόμενες μετρήσεις των αντισωμάτων.