Quality assessment of extra virgin olive oil (EVOO) and edible olive drupes using NMR spectroscopy and mass spectrometry (MS) metabolic profiling approaches: quantification studies and identification of biomarker compounds

Abstract

The field of nutrition regarding humankind has undergone numerous major pattern-shifts over the last centuries. Studies have turned their attention towards exploring the impact of nutrition on human health, from one’s well-being to heritable changes in expressed genetic landscapes. Bioactive compounds contained in food commodities, mainly of natural origin, have been greatly associated with plausible positive attributes in human health. Products of primary or secondary metabolism in plant goods belong to chemical classes like polyphenols, terpenes, sterols, carotenoids, minerals, stanols, alkaloids, coumarins, flavonoids and fatty acids. A broad spectrum of health-promoting effects has been linked with them, i.e. cardioprotective, antioxidative, anti-cancer, antibacterial, neuroprotective, immunomodulatory and anti-inflammatory. The introduction of new technologies and methods in the food industry has enabled the development of high throughput methodologies for the quality assessment of such commodities. The expectancy of consumers over certain characteristics such as organoleptic and nutritional, accompanied by resulting benefits and certain desirable traits that could justify the added value paid by the customer are novel additions to the term “Food Quality”. This also entails forms and area of production or botanical origin of the consumed goods. Products of the olive tree, with the primary focus on olive oil and table olives, have attracted the attention of the scientific world, especially since the issued health claims regarding the formers chemical composition linked with positive impacts in human health.In this context, olive oils from the top-3 producing countries worldwide, Spain, Italy and Greece, were selected and studied primarily in this thesis. Acknowledging the importance of sample preparation methods prior to analysis, the first attempt in this thesis was the comparison and optimization of already existing and new methods, and especially the ones suggested by the International Olive Council (IOC). Specifically, extraction (recovery of compounds) is one of the most critical decision-making steps in the analysis of foods since it defines qualitatively and quantitatively the compounds to be analyzed. Moreover, the analytical determination of OO biophenols was investigated since the already existing ones show several limitations and, most importantly, the HPLC-UV based method suggested by IOC to this day. Thus, different extraction and HPLC-UV based analytical procedures for the recovery of the total phenolic fraction (TPF) and the determination of their biophenol content (BC) were compared and new ones were proposed. Furthermore, single compounds, like tyrosol (Tyr), hydroxytyrosol (HT), oleacein (OLEA) and oleocanthal (OLEO), which are the most relevant to the EFSA claim, were quantified using the IOC and newly suggested HPLC-DAD-based analytical methods, as well as approaches such as the hydrolysis of biophenols. All qualitative and quantitative results (TPF, BC, Tyr, HT, OLEO, OLEA) were compared and evaluated towards the optimization of the entire procedure and determined in the selected commercial EVOO samples. NMR spectroscopy was employed for its robustness and quantitative traits in the determination of oleacein’s and oleocanthal’s levels in analyzed samples with different developed methods. Results from these different methodologies were compared for the first time in olive oil analysis. Metabolomics, an integrated approach that incorporates advanced analytical instrumentation, such as NMR magnets and high-resolution mass spectrometers, with the power of bioinformatics has enabled the accumulation and interpretation of large sets of data. Ultimately, this has led to the mapping of food products, among them olive oil, based on designation of origin, production procedure or botanical derivation, and the discovery of new bioactive compounds or markers that attach unique traits to the quality of a product. In this study, two different sets of samples were subjected to NMR-based metabolic profiling. Greek and European olive oils (commercial samples from Greece, Spain, Italy, other EU countries and blends) were investigated for tentative markers that would aid in the determination of their geographical, or even botanical origin in the case of Greek samples. The outcomes of the analysis of the two samples sets were integrated in a statistical manner. To our knowledge such a study in OO from top producing countries using NMR metabolomics has not been carried out to this day.Furthermore, as we insisted in strengthening the identification confidence of metabolites, a serious bottleneck in foodomics, Statistical Total Correlation Spectroscopy (STOCSY) was employed. STOCSY is a strong statistical tool that takes advantage of the multi-co-linearity of the variables’ intensity in a set of spectra to generate pseudo-NMR spectra, which display the correlation of intensities of the various peaks across the whole sample. Initially introduced for human metabolomics and with only a few applications existing in foodomics, it was used for the first time in EVOO analysis. This tool, in combination with recorded 2D spectra and a widespread literature search, has led to an ongoing assignment of compounds in the 1H NMR spectrum of the total extract of olive oils.Finally, NMR and HRMS metabolomic platforms were utilized for the investigation of Greek edible olive drupes. Table olives, despite the high levels of HT, are neglected compared to olive oil. Thus, in the present study the main Greek types of edible olives originating from different regions of the country, different cultivars and alternate debittering methods were investigated. STOCSY, 2D spectra and literature employed for NMR along with various dereplication tools in the case if HRMS, has led to an unprecedented characterization of their chemical profiles. Chemometrics was applied to both datasets, while discrimination models allowed the identification of certain compounds-markers that were specific to geographical origin, cultivar or debittering method. Overall, the combination of different approaches in the study of olive oils and table olives comprises a systematic attempt to expand our knowledge regarding their chemical composition and fraud and mislabeling. We aspire that our approaches and methods, aside from the olive field, will be useful for the analysis of other foods and foodstuffs. Metabolomics applications in this field, also known as “Foodomics” pose as an area of the future that will help overcome some of the challenges that it is faced with. Novel methodologies are turning out to be a necessity, in this day and age, under the global effort to assure food origin and quality control. NMR spectroscopy and MS approaches could certainly lift this weight for the years to come.

Ο τομέας της διατροφής όσον αφορά τον άνθρωπο έχει υποστεί πολλές σημαντικές αλλαγές στο μοτίβο τους τελευταίους αιώνες. Οριμένες μελέτες έχουν στρέψει την προσοχή τους στη διερεύνηση του αντίκτυπου της διατροφής στην ανθρώπινη υγεία, από την ευεξία έως τις κληρονομικές αλλαγές στα εκφρασμένα γενετικά τοπία. Οι βιοδραστικές ενώσεις που περιέχονται σε τρόφιμα, κυρίως φυσικής προέλευσης, έχουν συσχετιστεί σε μεγάλο βαθμό με πιθανά θετικά χαρακτηριστικά στην ανθρώπινη υγεία. Τα προϊόντα πρωτογενούς ή δευτερογενούς μεταβολισμού στα φυτικά προϊόντα ανήκουν σε χημικές τάξεις όπως πολυφαινόλες, τερπένια, στερόλες, καροτενοειδή, μέταλλα, στανόλες, αλκαλοειδή, κουμαρίνες, φλαβονοειδή και λιπαρά οξέα. Ένα ευρύ φάσμα θετικών δράσεων ως προς την υγεία έχει αποδοθεί σε αυτά, όπως καρδιοπροστατευτικό, αντιοξειδωτικό, αντικαρκινικό, αντιβακτηριακό, νευροπροστατευτικό, ανοσορυθμιστικό και αντιφλεγμονώδες. Η εισαγωγή νέων τεχνολογιών και μεθόδων στη βιομηχανία τροφίμων επέτρεψε την ανάπτυξη μεθοδολογιών υψηλής απόδοσης για την αξιολόγηση της ποιότητας τέτοιων προϊόντων. Η προσδοκία των καταναλωτών για ορισμένα χαρακτηριστικά, όπως οργανοληπτικά και θρεπτικά, συνοδευόμενα από προκύπτοντα οφέλη και ορισμένα επιθυμητά χαρακτηριστικά που θα μπορούσαν να δικαιολογήσουν την προστιθέμενη αξία που καταβάλλει ο πελάτης είναι νέες προσθήκες στον όρο «Ποιότητα Τροφίμων». Αυτό συνεπάγεται επίσης μορφές και περιοχή παραγωγής ή βοτανική προέλευση των καταναλωθέντων αγαθών. Τα προϊόντα της ελιάς, με πρωταρχική έμφαση στο ελαιόλαδο και τις επιτραπέζιες ελιές, έχουν προσελκύσει την προσοχή του επιστημονικού κόσμου, ιδιαίτερα μετά τους εκδοθέντες ισχυρισμούς υγείας σχετικά με τη χημική σύνθεση των προαναφερθέντων που συνδέθηκε με θετικές επιπτώσεις στην ανθρώπινη υγεία. Σε αυτό το πλαίσιο, επιλέχθηκαν και μελετήθηκαν σε αυτή τη διατριβή κυρίως τα ελαιόλαδα από τις κορυφαίες 3 χώρες παραγωγής παγκοσμίως, Ισπανία, Ιταλία και Ελλάδα. Αναγνωρίζοντας τη σημασία των μεθόδων προετοιμασίας των δειγμάτων πριν από την ανάλυση, η πρώτη προσπάθεια σε αυτή τη διατριβή ήταν η σύγκριση και βελτιστοποίηση ήδη υπαρχόντων και νέων μεθόδων, και ιδίως εκείνων που πρότεινε το Διεθνές Συμβούλιο Ελαιολάδου (IOC). Συγκεκριμένα, η εκχύλιση (ανάκτηση ενώσεων) είναι ένα από τα πιο κρίσιμα και αποφασιστικά στην ανάλυση τροφίμων, καθώς ορίζει ποιοτικά και ποσοτικά τις ενώσεις που θα αναλυθούν. Επιπλέον, διερευνήθηκε ο αναλυτικός προσδιορισμός των βιοφαινολών του ελαιολάδου, καθώς οι ήδη υπάρχουσες παρουσιάζουν αρκετούς περιορισμούς, και ειδικότερα η μέθοδος που βασίζεται σε HPLC-UV που προτείνει ο IOC μέχρι σήμερα. Έτσι, συγκρίθηκαν διαφορετικές μέθοδοι εκχύλισης και αναλυτικές μέθοδοι βασισμένες σε HPLC-UV για την ανάκτηση του συνολικού φαινολικού κλάσματος (TPF) και τον προσδιορισμό της περιεκτικότητάς του σε βιοφαινόλες (BC), ενώ προτάθηκαν και νέες. Επιπλέον, μεμονωμένες ενώσεις, όπως η τυροσόλη (Tyr), η υδροξυτυροσόλη (HT), η ολεασίνη (OLEA) και η ολεοκανθάλη (OLEO), οι οποίες είναι οι πιο σχετικές με τον ισχυρισμό υγείας της EFSA, ποσοτικοποιήθηκαν με τη χρήση της μεθόδου του IOC και νέων, προτεινόμενων αναλυτικών μεθόδων με βάση την HPLC-DAD, καθώς και προσεγγίσεων όπως η υδρόλυση των βιοφαινόλων. Όλα τα ποιοτικά και ποσοτικά αποτελέσματα (TPF, BC, Tyr, HT, OLEO, OLEA) συγκρίθηκαν και αξιολογήθηκαν προς τη βελτιστοποίηση ολόκληρης της διαδικασίας και προσδιορίστηκαν στα επιλεγμένα εμπορικά δείγματα EVOO. Η φασματοσκοπία NMR επιστρατεύτηκε για τη σταθερότητα και την ποσοτική της φύση στον προσδιορισμό των επιπέδων ολεασίνης και ολεοκανθάλης σε δείγματα με διαφορετικές αναπτυγμένες μεθόδους. Τα αποτελέσματα από αυτές τις διαφορετικές μεθοδολογίες συγκρίθηκαν για πρώτη φορά στην ανάλυση του ελαιολάδου. Η μεταβολομική, μια ολοκληρωμένη προσέγγιση που ενσωματώνει προηγμένα αναλυτικά όργανα, όπως μαγνήτες NMR και φασματόμετρα μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας, με τη δύναμη της βιοπληροφορικής, έχει επιτρέψει τη συσσώρευση και ερμηνεία υψηλών όγκων δεδομένων. Τελικά, αυτό έχει οδηγήσει στη χαρτογράφηση προϊόντων διατροφής, μεταξύ των οποίων το ελαιόλαδο, με βάση την ονομασία προέλευσης, τη διαδικασία παραγωγής ή τη βοτανική προέλευση και την ανακάλυψη νέων βιοδραστικών ενώσεων ή δεικτών που αποδίδουν μοναδικά χαρακτηριστικά στην ποιότητα ενός προϊόντος. Σε αυτή τη μελέτη, δύο διαφορετικά σύνολα δειγμάτων υποβλήθηκαν σε τεχνικές λήψης μεταβολομικού προφίλ με βάση το NMR. Ελληνικά και ευρωπαϊκά ελαιόλαδα (εμπορικά δείγματα από Ελλάδα, Ισπανία, Ιταλία, άλλες χώρες της ΕΕ και μείγματα) ερευνήθηκαν για πθανούς βιοδείκτες που θα βοηθούσαν στον προσδιορισμό της γεωγραφικής ή και της βοτανικής τους προέλευσης στην περίπτωση των ελληνικών δειγμάτων. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης των δύο συνόλων δειγμάτων ενσωματώθηκαν με στατιστικό τρόπο. Εξ' όσων γνωρίζουμε, δεν έχει διεξαχθεί μέχρι σήμερα μελέτη στο ελαιόλαδο από κορυφαίες χώρες παραγωγής με τη χρήση μεταβολομικής με την τεχνική του NMR.Επιπλέον, καθώς επιμείναμε στην ενίσχυση της εμπιστοσύνης ταυτοποίησης των μεταβολιτών, μία μεγάλη δυσκολία στα foodomics, επιστρατεύτηκε η Φασματοσκοπία Στατιστικής Ολικής Συσχέτισης (STOCSY). Το STOCSY είναι ένα ισχυρό στατιστικό εργαλείο που εκμεταλλεύεται την πολυ-γραμμικότητα της έντασης των μεταβλητών σε ένα σύνολο φασμάτων για τη δημιουργία ψευδο-NMR φασμάτων, τα οποία εμφανίζουν τη συσχέτιση των εντάσεων των διαφόρων κορυφών σε ολόκληρο το δείγμα. Αρχικά εισήχθη σε μελέτες μεταβολομικής σε βιολογικά δείγματα με λίγες μόνο εφαρμογές να υπάρχουν σε τρόφιμα, ενώ χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά στην ανάλυση EVOO. Αυτό το εργαλείο, σε συνδυασμό με καταγεγραμμένα 2D φάσματα και ευρεία αναζήτηση βιβλιογραφίας, έχει οδηγήσει σε μία συνεχιζόμενη απόδοση ενώσεων στο φάσμα 1Η NMR του συνολικού εκχυλίσματος ελαιολάδου. Τέλος, χρησιμοποιήθηκαν μεταβολομικές πλατφόρμες NMR και HRMS για τη διερεύνηση δειγμάτων ελληνικής επιτραπέζιας ελιάς. Οι επιτραπέζιες ελιές, παρά τα υψηλά επίπεδα HT, παραμελούνται σε σύγκριση με το ελαιόλαδο. Έτσι, στην παρούσα μελέτη ερευνήθηκαν οι κύριοι ελληνικοί τύποι βρώσιμων ελιών που προέρχονταν από διαφορετικές περιοχές της χώρας, διαφορετικές ποικιλίες και εναλλακτικές μεθόδους ξεπικρίσματος. STOCSY, 2D φάσματα και βιβλιογραφία χρησιμοποιήθηκαν για το NMR μαζί με διάφορα εργαλεία ταυτοποίησης στην περίπτωση του HRMS, οδήγησαν σε έναν άνευ προηγουμένου χαρακτηρισμό των χημικών τους προφίλ. Η χημειομετρία εφαρμόστηκε και στα δύο σύνολα δεδομένων, ενώ τα μοντέλα διάκρισης επέτρεψαν τον προσδιορισμό ορισμένων ενώσεων-δεικτών που ήταν συγκεκριμένοι για τη γεωγραφική προέλευση, τη μέθοδο καλλιέργειας ή τη μέθοδο ξεπικρίσματος. Συνολικά, ο συνδυασμός διαφορετικών προσεγγίσεων στη μελέτη των ελαιολάδων και των επιτραπέζιων ελιών περιλαμβάνει μια συστηματική προσπάθεια επέκτασης των γνώσεών μας σχετικά με τη χημική τους σύνθεση, την απάτη και την εσφαλμένη σήμανση. Φιλοδοξούμε ότι οι προσεγγίσεις και οι μέθοδοί μας, εκτός από το ελαιόλαδο και την επιτραπέζια ελιά, θα είναι χρήσιμες για την ανάλυση άλλων τροφίμων. Οι εφαρμογές μεταβολομικής με αυτό το αντικείμενο, γνωστές και ως «Foodomics», αποτελούν ένα τομέα του μέλλοντος που θα βοηθήσει να ξεπεραστούν ορισμένες από τις προκλήσεις που ήδη αντιμετωπίζει. Οι νέες μεθοδολογίες αποδεικνύονται αναγκαιότητα σε αυτήν την εποχή και υπό την παγκόσμια προσπάθεια διασφάλισης της προέλευσης των τροφίμων και του ποιοτικού ελέγχου. Η φασματοσκοπία NMR και οι προσεγγίσεις MS θα μπορούσαν σίγουρα να σηκώσουν αυτό το βάρος για τα επόμενα χρόνια.