Ο ρόλος της ακτιβίνης-Α στην καταστολή αυτοάνοσων αντιδράσεων σε πειραματικά μοντέλα σκλήρυνσης κατά πλάκας και σε ασθενείς με αυτοάνοσα νοσήματα

Abstract

Introduction and Purpose: T helper type cells 17 (Th17) exhibit functional heterogeneity fostering both pathogenic and nonpathogenic, tissue-protective functions. In multiple sclerosis (MS), pathogenic Th17 cells are critical drivers of autoimmune central nervous system (CNS) inflammation and demyelination. Still, the factors that control Th17 cell pathogenicity remain incompletely defined. Activin-A is a pleiotropic cytokine that is involved in a variety of biological processes and exerts both pro- and anti- inflammatory functions. Our previous studies revealed that activin-A restrains Th2 allergic responses in asthmatic individuals and protects against experimental asthma. Still, the role of activin-A in autoimmune responses that are mediated with auto-reactive Τh1 and Th17 cells remains to be elucidated. Our hypothesis is that activin-A plays a key role in Th17 pathogenicity and linked CNS autoimmune inflammation. Our aims are to investigate a) the role of activin-A in the regulation of autoimmune CNS inflammation in vivo and b) to explore the molecular mechanisms that are involved in the suppressive effects of activin-A on the pathogenicity of Th17 cells. Materials and Methods: The in vivo role of activin-A in MS was explored following therapeutic administration in a C57BL/6 mouse model of MS, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The effects of activin-A on the regulation of Th17 pathogenicity in vivo were examined through adoptive transfer Τh17 cells in to immunosuppressed Rag-/- mice following EAE induction. Functional experiments were also performed in Nt5e and Phd2 deficient mice. Th17 cells were generated in vitro under highly-pathogenic conditions (IL-6, IL-1β, IL-23) and the effects of activin-A on their transcriptional and phenotypic profile were examined by flow cytometry, ELISA, qPCR, RNA-seq, immunofluorescence, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays and confocal microscopy analyses. Bioinformatics, proteomics and metabolomics analyses deciphered the molecular mechanisms underlying the effects of activin-A on Th17 pathogenicity. The levels of activin-A were measured in the serum and cerebrospinal fluid of individuals with RRMS, (n=23), healthy donors (n=10) and patients with other non-autoimmune diseases (n=20). Finally, the role of activin-A on human Th17 differentiation and effector CD4+T cells responses of patients with MS was examined. Results: Our findings demonstrated that in vivo therapeutic administration of activin-A in EAE mice, ameliorated disease severity and alleviated CNS immunopathology and demyelination, associated with decreased activation of pathogenic Th17 cells. During Th17 cell differentiation, activin-A stimulation repressed genes linked to Th17 pathogenicity, including Ifng, Csf2, Il1b, Tbx21 and Batf, concomitant with an upregulation of genes associated with non-pathogenic Th17 cells, such as, Il10, Maf and Ahr. The aforementioned effects were mediated by activin-A’s canonical signaling pathway, involving activin-like kinase-4 (ALK) receptor and the transcriptional factors phosphoSmad2/3. Extended analysis of the whole genome (RNAseq), combined with in vivo studies, revealed that activation of the ATP-depleting CD39 and CD73 ectonucleotidases is essential for activin-A–induced suppression of the pathogenic signature and the encephalitogenic functions of Th17 cells. Mechanistical studies, found that transcription factor aryl hydrocarbon receptor (Ahr), along with STAT3 and c-Maf, are recruited to promoter elements on Entpd1 and Nt5e (encoding CD39 and CD73 ectonucleotidases, respectively) and on anti-inflammatory cytokine IL-10 and control their expression in Th17 cells in response to activin-A. Moreover, we showed that activin-A negatively regulates the expression and stability of the metabolic sensor, hypoxia-inducible factor-1α, and key inflammatory proteins linked to pathogenic Th17 cell states. Finally, we demonstrated that activin-A is induced in the CNS of individuals with MS and its presence restrains human Th17 cell-mediated responses. Conclusions: Our studies uncovered activin-A as a critical controller of Th17 cell pathogenicity that can be targeted for the suppression of autoimmune CNS inflammation.

Εισαγωγή & Σκοπός: Τα βοηθητικά λεμφοκύτταρα τύπου 17 (Th17) παρουσιάζουν φαινοτυπική και λειτουργική ετερογένεια επιδεικνύοντας παθογενετικές και μη- παθογενετικές, ιστο- προστατευτικές λειτουργίες. Τα παθογενετικά Th17 κύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη αυτοάνοσης φλεγμονής του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) και στην απομυελίνωση, στη σκληρυνση κατά πλάκας (ΣΚΠ). Μέχρι και σήμερα, οι παράγοντες που εμποδίζουν την παθογενετική δράση των Th17 κυττάρων δεν έχουν καθοριστεί πλήρως. Η ακτιβίνη-Α είναι μια κυτταροκίνη που επιτελεί βασικές βιολογικές διεργασίες και επιδεικνύει προ- και αντι-φλεγμονώδεις δράσεις. Προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας, αποκάλυψαν ότι η ακτιβίνη-Α καταστέλλει τις Th2-διαμεσολαβούμενες αλλεργικές αποκρίσεις, σε ασθενείς με αλλεργικό άσθμα και προστατεύει από την ανάπτυξη άσθματος σε πειραματικά μοντέλα. Παρόλα αυτά ο ρόλος της ακτιβίνης-Α, στις αυτοάνοσες ανοσολογικές αποκρίσεις, που μεσολαβούνται από αυτοειδικά Th1 και Th17 κύτταρα, δεν έχει αποσαφηνιστεί. Στην παρούσα ερευνητική εργασία, υποθέσαμε ότι η ακτιβίνη-Α καταστέλλει την παθογενετική δράση των Th17 κυττάρων στην αυτοάνοση φλεγμονή που παρουσιάζεται στο ΚΝΣ και περιορίζει τη σοβαρότητα της νόσου. Σκοποί μας είναι: α) η μελέτη της δράσης της ακτιβίνης-Α στη ρύθμιση της παθογενετικής λειτουργίας των Th17 κυττάρων in vivo, και β) η διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών που οδηγούν στην κατασταλτική δράση της ακτιβίνης-Α στα παθογενετικά Th17 κύτταρα. Υλικά & Μέθοδοι: Ο in vivo ρόλος της ακτιβίνης-Α στη ΣΚΠ μελετήθηκε με θεραπευτική χορήγησή της ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης στο πειραματικό μοντέλο της αυτοάνοσης πειραματικής εγκεφαλομυελίτιδας (ΠΑΕ), σε C57BL/6 ποντίκια, που αποτελεί ένα καθιερωμένο πειραματικό μοντέλο της ΣΚΠ. Η επίδραση της ακτιβίνης-Α στη ρύθμιση της παθογενετικής λειτουργίας των Th17 κυττάρων in vivo, μελετήθηκε με πειράματα μεταφοράς Th17 κυττάρων σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια Rag-/-, μετά την επαγωγή της ΠΑΕ. Μηχανιστικές μελέτες πραγματοποιήθηκαν επίσης σε ποντίκια με έλλειψη του γονιδίου Nt5e-/- και Phd2-/-. Εξετάσθηκε ο ρόλος της ακτιβίνης-Α σε Th17 κύτταρα, διαφοροποιημένα υπό παθογενετικές συνθήκες (IL-6, IL-1β, IL-23), στην τροποποίηση του μεταγραφικού και φαινοτυπικού προφίλ των Th17 κυττάρων, με τεχνικές κυτταρομετρίας ροής, ELISA, qPCR, RNA-seq, ανοσοφθορισμού, κατακρήμνισης της χρωματίνης (ChIP) και συνεστιακή μικροσκοπία. Bιοπληροφορικές, πρωτεομικές και μεταβολικές αναλύσεις, εξέτασαν τους μοριακούς μηχανισμούς, μέσω των οποίων η ακτιβίνη-Α επηρεάζει τη διαφοροποίηση παθογενετικών Th17 κυττάρων. Μετρήθηκαν τα επίπεδα ακτιβίνης-Α σε ορό και εγκεφαλονωτιαίο υγρό ασθενών με ΣΚΠ, υποτροπιάζουσας μορφής (n=23), υγιών-μαρτύρων (n=10) και μαρτύρων με μη αυτοάνοση ασθένεια (n=11). Τέλος, διερευνήθηκε η δράση της ακτιβίνης-Α στη διαφοροποίηση ανθρώπινων Th17 κυττάρων και στις φλεγμονώδεις αποκρίσεις των CD4+T κυττάρων από ασθενείς με ΣΚΠ. Αποτελέσματα: Τα ευρήματά μας έδειξαν ότι η θεραπευτική χορήγηση της ακτιβίνης-Α στην ΠΑΕ ελάττωσε τη σοβαρότητα της νόσου και περιόρισε την ανοσοπαθολογία του ΚΝΣ καθώς και την απομυελίνωση, μέσω κυρίως της μειωμένης ενεργοποίησης των παθογενετικών Th17 κυττάρων. Η διαφοροποίηση των Th17 κυττάρων παρουσία ακτιβίνης-Α κατέστειλε γονίδια που σχετίζονται με παθογενετικά Th17 κύτταρα όπως Ifng, Csf2, Il1b, Tbx21 και Batf, ενώ ταυτόχρονα οδήγησε σε σημαντική αύξηση γονιδίων που σχετίζονται με μη παθογενετικά Th17 κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των Il10, Maf και Ahr. Οι δράσεις αυτές της ακτιβίνης-Α πραγματοποιήθηκαν κυρίως μέσω του κύριου σηματοδοτικού μονοπατιού που περιλαμβάνει τον υποδοχέα ALK4 και τους μεταγραφικούς παράγοντες Smad2/3. Εκτεταμένες αναλύσεις του γονιδιώματος (RNAseq) καθώς και in vivo μελέτη, αποκάλυψαν ότι η ενεργοποίηση των CD39 και CD73 εκτονουκλεοτιδασών που τροποποιούν το ATP σε αδενοσίνη, είναι απαραίτητη για την κατασταλτική δράση της ακτιβίνης-Α τόσο στην παθογενετική ταυτότητα όσο και στις εγκεφαλοτοξικές λειτουργίες των Th17 κυττάρων. Όσον αφορά τους μοριακούς μηχανισμούς δράσης της ακτιβίνης-Α, δείξαμε ότι ο μεταγραφικός υποδοχέας, aryl hydrocarbon (Ahr), μαζί με τους STAT3 και c-Maf, επιστρατεύονται στους υποκινητές των γονιδίων Entpd1 και Nt5e (που κωδικοποιούν για τις CD39 και CD73 εκτονουκλεοτιδάσες, αντίστοιχα) καθώς και της αντι-φλεγμονώδους κυτταροκίνης IL-10, ελέγχοντας την έκφρασή τους στα Th17 κύτταρα. Δείξαμε επίσης, ότι η ακτιβίνη-Α ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση και την πρωτεΐνική σταθερότητα του μεταβολικού παράγοντα, hypoxia-inducible factor-1-α (Hif1-α) καθώς και ποικίλες προ-φλεγμονώδεις πρωτεΐνες –κλειδιά που σχετίζονται με την παθογενετική δράση των Th17 κυττάρων. Τέλος δείξαμε ότι η ακτιβίνη-Α αυξάνεται στο ΚΝΣ ατόμων με ΣΚΠ και η παρουσία της έχει την ικανότητα να καταστέλλει τις φλεγμονώδεις Th17 μεσολαβούμενες κυτταρικές αποκρίσεις στους ασθενείς. Συμπεράσματα: Τα παραπάνω ευρήματα αποκαλύπτουν την ακτιβίνη-Α, ως ένα νέο κρίσιμο ρυθμιστή της παθογενετικής δράσης των Th17 κυττάρων που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σα μόριο-στόχος για την καταστολή της αυτοάνοσης φλεγμονής στο ΚΝΣ.