Μοριακός χαρακτηρισμός δυνητικώς τοξικών στελεχών βακτηρίων και πρωτίστων από υδάτινα οικοσυστήματα: το παράδειγμα του Αμβρακικού Κόλπου

Abstract

Harmful algal blooms, or HABs, occur when colonies of algae grow out of control and produce toxic or harmful effects on people, fish, shellfish, marine mammals and birds. The human illnesses caused by HABs, though rare, can be debilitating or even fatal. Consumption of shellfish containing biotoxins threatens human’s health through poisoning. Depending on the symptoms they cause, these poisonings are classified as: Amnesic Poisoning (ASP) (toxin: Domoic Acid), Paralytic Poisoning (PSP) (Saxitoxins), Hepatic Poisoning (HSP) (Microcystins), Diarrhea Poisoning (DSP)(Okadaic acid and dinophysotoxins) and Neurotoxic Poisoning (NSP) (Brevetoxins). From previous research data, toxins of amnesic, paralytic, hepatic, diarrheal and neurotoxic poisoning have been reported in Amvrakikos Gulf. The organisms that have been implicated in the production of these toxins have only been identified by microscopic observation. In the present work, we investigated the presence of marine biotoxins in mussel tissues collected seasonally from six sampling sites around the Gulf of Amvrakikos. The biotoxins were determined by a specific toxin assay using the ELISA method. We confirmed the presence of four of the five toxins we studied (brevetoxins, microcystins, okadaic acid and domoic acid). Saxitoxins were below the detection limit of the method. In contrast to the other toxins reported, the presence of microcystin in the mussels from the Amvrakikos Gulf is strong (18.6 - 117.5 ng/g ww) throughout the year. The daily intake of microcystin consumed by an adult 70kg is 18ng/g. All the samples we had were above this safety limit. From surface water samples, we identified the microorganisms that are likely to produce these toxins, using molecular techniques. We constructed a gene library for the 16S-ITS-23S rDNA region of cyanobacteria. Most cyanobacteria belong to the genus Synechococcus, to subcluster 5.3. Cyanobacteria of this subcluster occur mainly in the Mediterranean, in the Sargasso Sea and in the East Sea. For a more detailed analysis of the biodiversity of cyanobacteria and protists, we continued with new generation sequencing (NGS). The results of NGS analysis indicate the existence of 7 cyanobacterial OTUs, common in all our samples, with 4 of them covering >90% of the cyanobacterial population. All belong to the genus Synechococcus. No cyanobacteria were found to belong to a genus known for microcystin production (Microcystis, Anabaena, Anabaenopsis, Oscillatoria). As far as protists are concerned, most of them belong to the Superphylum: Alveolata and the Phylum: Dinoflagellata. Among the samples, there are 23 OTU prototypes present in all samples, with 11 of them abundant (>1% of the sample). Their percentage composition among the samples varies both in the sampling location and in the season, without following any standard. Among the OTUs of the protista of the known potentially toxic genera are Alexandrium and Gymnodinium - responsible for PSP - and Prorocentrum and Dinophysis - responsible for DSP.In the third and final part of our work, we tried to cultivate microcystin-producing cyanobacteria. One of the cultures was found to produce microcystin after successive passages. Molecular characterization of this culture showed the presence of OTUs corresponding to cyanobacteria of the genus Microcystis. We then investigated the existence of two genes in the microcystin-producing operon (mcyA-NMT and mcyA-Cd) and obtained a positive result only for the mcyA-NMT gene. The present thesis reveals that the Amvrakikos Gulf is an ecosystem, with great biodiversity and heterogeneity still in the protists bio-community. Of the toxins studied, microcystin is of particular interest. Subsequent studies may focus on the isolation of those cyanobacteria responsible for microcystin production.

Η ραγδαία αύξηση πληθυσμού φυκών σε υδάτινα οικοσυστήματα με ταυτόχρονη παραγωγή βιοτοξινών είναι ένα φαινόμενο γνωστό ως επιβλαβής άνθιση φυκών (HAB – Harmful Algal Bloom). Οι βιοτοξίνες αυτές παράγονται από πλαγκτονικούς οργανισμούς (κυανοβακτήρια και πρώτιστα) και συσσωρεύονται στα οστρακοειδή. Κατανάλωση οστρακοειδών που περιέχουν βιοτοξίνες απειλεί την ανθρώπινη υγεία μέσω δηλητηριάσεων. Αναλόγως των συμπτωμάτων που προκαλούν, οι δηλητηριάσεις αυτές διακρίνονται σε: Αμνησιακή δηλητηρίαση (ASP) (τοξίνη: δομοϊκό οξύ), Παραλυτική δηλητηρίαση (PSP) (σαξιτοξίνες), Ηπατική δηλητηρίαση (HSP) (μικροκυστίνες), Διαρροϊκή δηλητηρίαση (DSP) (οκαδαϊκό οξύ και δινοφυσιοτοξίνες) και Νευροτοξική δηλητηρίαση (NSP) (μπρεβετοξίνες). Από προηγούμενα ερευνητικά δεδομένα, έχει αναφερθεί η ύπαρξη τοξινών αμνησιακής, παραλυτικής, ηπατικής, διαρροϊκής και νευροτοξικής δηλητηρίασης στον Αμβρακικό Κόλπο. Οι οργανισμοί που έχουν ενοχοποιηθεί για την παραγωγή των τοξινών αυτών έχουν προσδιοριστεί μόνο με μικροσκοπική παρατήρηση. Στη παρούσα εργασία μελετήσαμε την ύπαρξη θαλασσίων βιοτοξινών σε ιστούς μυδιών που συλλέχθηκαν εποχικά από έξι θέσεις δειγματοληψίας περιμετρικά του Αμβρακικού Κόλπου. Ο προσδιορισμός των βιοτοξινών έγινε με εξειδικευμένη για κάθε τοξίνη δοκιμασία, με την μέθοδο της ELISA. Επιβεβαιώσαμε την ύπαρξη τεσσάρων από τις πέντε τοξίνες που μελετήσαμε: μπρεβετοξίνες (1,65 – 68,25ng/g ww), μικροκυστίνες (18,6 – 117,5ng/g), οκαδαϊκό οξύ 19,6 – 494,1ng/g) και δομοϊκό οξύ). Οι σαξιτοξίνες ήταν κάτω από το όριο ανίχνευσης της μεθόδου. Σε αντίθεση με τις υπόλοιπες τοξίνες που αναφέρθηκαν, η παρουσία της μικροκυστίνης στα μύδια από τον Αμβρακικό Κόλπο είναι έντονη σε όλη τη διάρκεια του έτους. Από δείγματα επιφανειακού νερού, προσπαθήσαμε να ταυτοποιήσουμε τους μικροοργανισμούς που πιθανά παράγουν τις τοξίνες αυτές, χρησιμοποιώντας μοριακές τεχνικές. Πιο συγκεκριμένα κατασκευάσαμε μια γονιδιακή βιβλιοθήκη για την περιοχή 16S-ITS-23S rDNA των κυανοβακτηρίων. Τα περισσότερα κυανοβακτήρια ανήκουν στο γένος Synechococcus και συγκεκριμένα στην ομάδα 5.3. Κυανοβακτήρια της ομάδας αυτής εμφανίζονται κυρίως στην Μεσόγειο, στη Θάλασσα των Σαργασσών και στην Ανατολική Θάλασσα. Για λεπτομερέστερη ανάλυση της βιοποικιλότητας των κυανοβακτηρίων και των πρωτίστων, συνεχίσαμε με αλληλούχιση νέας γενιάς (NGS). Τα αποτελέσματα της NGS ανάλυσης δείχνουν την ύπαρξη 7 κοινών OTU κυανοβακτηρίων σε όλα τα δείγματα μας, ενώ 4 από αυτές καλύπτουν >90% του πληθυσμού των κυανοβακτηρίων. Όλες ανήκουν στο γένος Synechococcus. Δεν βρέθηκε κάποιο κυανοβακτήριο να ανήκει σε γένος που ξέρουμε πως παράγει μικροκυστίνη. Τα περισσότερα πρώτιστα ανήκουν στην υπερσυνομοταξία των Κυψελιδωτών (Alveolata) και στην συνομοταξία των Δινομαστιγωτών (Dinoflagellata). Μεταξύ των δειγμάτων, υπάρχουν 23 OTU πρωτίστων, παρούσες σε όλα τα δείγματά μας, με 11 από αυτές να είναι άφθονες (>1% του δείγματος). Στο σύνολο των OTU των πρωτίστων από τα γνωστά δυνητικά τοξικά γένη υπάρχουν τα Alexandrium και Gymnodinium – υπεύθυνα για την παραγωγή τοξινών παραλυτικής δηλητηρίασης - και Prorocentrum και Dinophysis – υπεύθυνα για την παραγωγή τοξινών διαρροϊκής δηλητηρίασης. Στο τρίτο και τελευταίο μέρος της εργασίας μας, προσπαθήσαμε να καλλιεργήσουμε κυανοβακτήρια που παράγουν μικροκυστίνη. Μια καλλιέργεια βρέθηκε να παράγει μικροκυστίνη μετά από διαδοχικές ανακαλλιέργειες. Μοριακός χαρακτηρισμός της συγκεκριμένης καλλιέργειας έδειξε την ύπαρξη OTU που αντιστοιχούν σε κυανοβακτήρια του γένους Microcystis. Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την ύπαρξη δύο γονιδίων του οπερονίου παραγωγής μικροκυστίνης (mcyA-NMT και mcyA-Cd) και πήραμε θετικό αποτέλεσμα μόνο για το γονίδιο mcyA-NMT. Η παρούσα διατριβή αποκαλύπτει ότι ο Αμβρακικός Κόλπος είναι ένα οικοσύστημα, με μεγάλη βιοποικιλότητα και ετερογένεια ακόμη κυρίως στα πρώτιστα. Από τις τοξίνες που μελετήθηκαν, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η μικροκυστίνη. Επόμενες μελέτες μπορούν να επικεντρωθούν στην απομόνωση εκείνων των κυανοβακτηρίων που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή μικροκυστίνης.