Ανάπτυξη, εφαρμογή και αξιολόγηση χημικών αναλόγων του Sudan Black B στην ανθρώπινη νόσο

Abstract

Cellular senescence is an essentially irreversible cell-cycle arrest that can be an alarm response instigated by numerous stressors, including exposure to genotoxic agents, nutrient deprivation. It is a cell state implicated in various physiological processes and a wide range of age-related diseases and contributes to organismal development, aging, and diverse pathologies. Senescence is, also, important as an anti-tumour barrier to carcinogenesis. However, if tissue damage continues and macrophage attraction is reduced, senescent cells are not able to inhibit adenoma development and carcinogenesis, creating an environment conducive to tumor growth. To date, the most widely used method to detect senescent cells is Senescence- associated b-galactosidase activity (SA-b-gal) assay. This biomarker, however, has many disadvantages, making it increasingly difficult to study senescence in various cellular systems. Recently, it has been reported specific recognition of senescent cells in biological material including cultured cells, fresh/frozen, and archival (formalin-fixed and paraffin-embedded, FFPE) tissues, applying the Sudan Black B (SBB) histochemical dye. SBB reacts with lipofuscin, a non degradable aggregate of oxidized proteins, lipids, and metals. Lipofuscin accumulates in senescent cells, as a by- product of the senescent process, and should be considered as a new ‘hallmark’ of senescence. There was, therefore, a scientific idea to synthesize new chemical compounds, which detect lipofuscin, and therefore senescent cells. We designed and synthesized a lipophilic, biotin-linked Sudan Black B (SBB) analogue, GL13, suitable for sensitive and specific, antibody-enhanced detection of lipofuscin-containing senescent cells in any biological material. This new hybrid histo-/immunochemical method is easy to perform, reliable, and universally applicable to assess senescence in biomedicine, from cancer research to gerontology. During the doctoral dissertation, the phenomenon of cellular senescence in the blood serum of healthy and pathological samples was also examined, measuring the levels of lipofuscin. The healthy were classified into two categories depending on age, while the patients were classified according to the disease from which they suffer. The diseases that were examined were heart failure, rheumatoid arthritis, cancer and neurodegenerative diseases. The aim of these experiments was to investigate whether lipofuscin levels in blood serum vary according to age and in what percentage, as well as whether these levels change in some diseases, possibly indicating lipofuscin as a future prognosis biomarker.

Η κυτταρική γήρανση αποτελεί το στάδιο της μη αναστρέψιμης, στις περισσότερες περιπτώσεις, διακοπής της κυτταρικής ανάπτυξης, στην οποία το κύτταρο παραμένει μεταβολικά ενεργό. Εμπλέκεται στην εμβρυϊκή ανάπτυξη, σε φυσιολογικές καταστάσεις, στο γήρας (aging), καθώς και σε παθολογικές καταστάσεις. Η συνεισφορά της μπορεί να είναι θετική, όπως στην περίπτωση της επούλωσης πληγής, ή να έχει αρνητικά αποτελέσματα, όπως στην περίπτωση της σαρκοπενίας. Η γήρανση είναι εξίσου σημαντική, καθώς αποτελεί φραγμό της καρκινογένεσης. Αν, όμως, συνεχιστεί η βλάβη του ιστού και γίνει μειωμένη προσέλκυση των μακροφάγων, τότε η γήρανση παύει να αναστέλλει την ανάπτυξη του αδενώματος και δημιουργεί ένα περιβάλλον ευνοϊκό για την ανάπτυξη του όγκου. Μέχρι σήμερα, ο δείκτης που χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό της γήρανσης, είναι ο SA β-gal. Ο δείκτης αυτός, όμως, παρουσιάζει πολλά μειονεκτήματα, με αποτέλεσμα να γίνεται όλο και πιο δύσκολη η μελέτη της γήρανσης στα διάφορα κυτταρικά συστήματα. Πρόσφατα ανακαλύφθηκε μία πιο βελτιωμένη, και με ευρεία εφαρμογή, νέα τεχνική ανίχνευσης των γηρασμένων κυττάρων, που βασίζεται στην χρώση με Sudan Black B (SBB), η οποία με την σειρά της έχει κάποιες τεχνικές προκλήσεις. Υπήρξε, λοιπόν, η ανάγκη για την σύνθεση νέων χημικών ενώσεων, οι οποίες εντοπίζουν τη λιποφουσκίνη, και επομένως τα γηρασμένα κύτταρα. Οι ενώσεις, αυτές, δοκιμάστηκαν σε συστήματα αναφοράς για τη γήρανση και το αποτέλεσμα ήταν ενθαρρυντικό. Το νέο χημικό ανάλογο του SBB, το οποίο ονομάζεται GL13 δεσμεύεται ειδικά και με ευαισθησία με τη λιποφουσκίνη. Χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο GL13 αναπτύξαμε μία υβριδική ιστοχημική-ανοσοϊστοχημική μέθοδο και δείξαμε ότι η συσσώρευση λιποφουσκίνης αποτελεί ορόσημο της γήρανσης σε μεγάλη ποικιλία βιολογικών δειγμάτων. Κατά τη διάρκεια της διδακτορικής διατριβής εξετάστηκε, επίσης, το φαινόμενο της κυτταρικής γήρανσης στον ορό του αίματος υγειών και ασθενών ατόμων, μετρώντας τα επίπεδα της λιποφουσκίνης. Οι υγιείς ταξινομήθηκαν σε δύο κατηγορίες ανάλογα με την ηλικία, ενώ οι ασθενείς ταξινομήθηκαν ανάλογα με την ασθένεια από την οποία πάσχουν. Οι ασθένειες που εξετάσθηκαν είναι η καρδιακή ανεπάρκεια, η ρευματοειδής αρθρίτιδα, ο καρκίνος και οι νευροεκφυλιστικές παθήσεις. Βασική ιδέα αυτών των πειραμάτων είναι να ερευνήσουμε αν τα επίπεδα της ελεύθερης λιποφουσκίνης στον ορό διαφοροποιούνται ανάλογα με την ηλικία και σε τι ποσοστό, καθώς επίσης, αν αυτά τα επίπεδα αλλάζουν σε κάποιες ασθένειες, αποτελώντας, ίσως, μελλοντικό προγνωστικό δείκτη.