Περίληψη
Η απολιποπρωτεΐνη Α1 (ApoA-I) , ως κύριο συστατικό της HDL, εμπλέκεται στην αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης, ενώ παράλληλα παρουσιάζει αντιθρομβωτικές, αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις και ανοσορυθμιστικές ιδιότητες, οι οποίες είναι συναφείς του προστατευτικού της ρόλο σε καρδιαγγειακές, φλεγμονώδεις και κακοήθεις παθολογίες. Oι στόχοι αυτής της διδακτορικής διατριβής είναι (1) ο προσδιορισμός μετα-μεταγραφικών μηχανισμών ρύθμισης των ενδοκυττάριων επιπέδων της ApoA-I και (2) η διερεύνηση πιθανών ενδοκυττάριων λειτουργιών της, φαινόμενα τα οποία έχουν ελάχιστα διερευνηθεί. Το αντικείμενο της μελέτης που περιγράφεται στο κεφάλαιο 1 σχετίζεται με τη ρύθμιση της ApoA-I στα ηπατοκύτταρα από μετα-μεταγραφικούς μηχανισμούς και πρωτεολυτικά συστήματα. Χρησιμοποιήσαμε την καρκινική σειρά ηπατοκυττάρων HepG2 και πρωτογενή ηπατοκύτταρα ποντικού ως in vitro μοντέλο για τη μελέτη της επίδρασης γενετικών και χημικών παρεμποδιστών της αυτοφαγίας και του πρωτεοσώματος, και εξετάσαμε την ApoA-I με ...
Η απολιποπρωτεΐνη Α1 (ApoA-I) , ως κύριο συστατικό της HDL, εμπλέκεται στην αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης, ενώ παράλληλα παρουσιάζει αντιθρομβωτικές, αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις και ανοσορυθμιστικές ιδιότητες, οι οποίες είναι συναφείς του προστατευτικού της ρόλο σε καρδιαγγειακές, φλεγμονώδεις και κακοήθεις παθολογίες. Oι στόχοι αυτής της διδακτορικής διατριβής είναι (1) ο προσδιορισμός μετα-μεταγραφικών μηχανισμών ρύθμισης των ενδοκυττάριων επιπέδων της ApoA-I και (2) η διερεύνηση πιθανών ενδοκυττάριων λειτουργιών της, φαινόμενα τα οποία έχουν ελάχιστα διερευνηθεί. Το αντικείμενο της μελέτης που περιγράφεται στο κεφάλαιο 1 σχετίζεται με τη ρύθμιση της ApoA-I στα ηπατοκύτταρα από μετα-μεταγραφικούς μηχανισμούς και πρωτεολυτικά συστήματα. Χρησιμοποιήσαμε την καρκινική σειρά ηπατοκυττάρων HepG2 και πρωτογενή ηπατοκύτταρα ποντικού ως in vitro μοντέλο για τη μελέτη της επίδρασης γενετικών και χημικών παρεμποδιστών της αυτοφαγίας και του πρωτεοσώματος, και εξετάσαμε την ApoA-I με ανοσοαποτύπωση, ανοσοφθορισμό και ηλεκτρονική μικροσκοπία. Διαφορετικές συνθήκες ανάπτυξης εφαρμόστηκαν σε συνδυασμό με παρεμποδιστές του mTOR προκειμένου να προσομοιάσουμε την επίδραση περιορισμένων θρεπτικών σε σύγκριση με επάρκεια θρεπτικών στη ρύθμιση της ApoA-I. Η έκφραση της ApoA-I στο ήπαρ μελετήθηκε σε ποντίκια που θράφηκαν με δίαιτα υψηλών λιπαρών και παρουσιάζουν παρεμπόδιση της αυτοφαγίας. Τα αποτελέσματα μας κατέδειξαν ότι η φαρμακολογική παρεμπόδιση της αυτοφαγίας και όχι του πρωτεοσώματος συνεπάγεται τη συσσώρευση της ApoA-I στα ηπατοκύτταρα. Για να εξετάσουμε λεπτομερώς τα μοριακά μονοπάτια που διέπουν την αποικοδόμηση της ApoA-Ι από την αυτοφαγία χρησιμοποιήσαμε γενετική αποσιώπηση σημαντικών ρυθμιστών της αυτοφαγικής μηχανής και παρακολουθήσαμε τα επίπεδα έκφρασης της ApoA-I. Παρατηρήσαμε ότι η πρωτεόλυση της ApoA-I διέπεται από ένα κανονικό μονοπάτι αυτοφαγίας στο οποίο συμμετέχει η Beclin1, η ULK1 και η πρωτεΐνη p62 που φαίνεται να στοχεύει την ApoA-I στα αυτοφαγοσώματα. Στη συνέχεια αναλύσαμε τα επίπεδα της ApoA-I υπό συνθήκες περιορισμένων θρεπτικών, οι οποίες επάγουν αυτοφαγία ενώ παράλληλα μπλοκάρουν αναβολικές διαδικασίες, όπως η μετάφραση, μέσω του mTORC1 μονοπατιού. Διαπιστώσαμε ότι εφαρμόζοντας στέρηση θρεπτικών παρατηρείται ότι η καταστολή της σύνθεσης της ApoA-I επικρατεί στη ρύθμιση των επιπέδων της πρωτεΐνης σε σχέση με την επίδραση της πρωτεόλυσης της ApoA-I μέσω της αυτοφαγίας. Αυτά τα δεδομένα αναδεικνύουν τη μεγάλη συνεισφορά μετα-μεταγραφικών μηχανισμών στη ρύθμιση των επιπέδων της ApoA-I στην οποία εμπλέκεται η εξαρτωμένη mTORC1 σηματοδότηση που αναλόγως με τις συνθήκες διαθέσιμων θρεπτικών καθορίζει την αυτοφαγία ή την πρωτεϊνική σύνθεση ως το κύριο μηχανισμό ελέγχου των επίπεδών της. Δεδομένου του εδραιωμένου ρόλου της ApoA-I στην αντίστροφη μεταφορά χοληστερόλης, η ρύθμιση αυτή της ApoA-I θα μπορούσε να αντανακλά μια ηπατική απάντηση σε οργανικές απαιτήσεις για την διατήρηση των αποθηκών χοληστερόλης και λιπιδίων υπό αντίξοες θρεπτικές συνθήκες. Καθώς παρατηρήσαμε ότι η έκφραση της ApoA-I σε ηπατοκύτταρα μπορεί να ρυθμιστεί ανάλογα στη διαθεσιμότητα των θρεπτικών, μας ενδιέφερε να μελετήσουμε αν η ApoA-I μπορεί να λειτουργήσει ως διαμεσολαβητικό μόριο ανταποκρινόμενο στις μεταβολικές ανάγκες του κυττάρου. Στο κεφάλαιο 2 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της μελέτης που εστιάζει στην αποσαφήνιση πιθανής ενδοκυττάριας λειτουργίας της ApoA-I στη ρύθμιση του λιπιδικού μεταβολισμού. Με αφορμή τις δημοσιευμένες παρατηρήσεις (1) ότι η καταστολή της αυτοφαγίας οδηγεί σε συσσώρευση μεγάλου μεγέθους λιπιδικών σταγόνων σε κυτταρικά συστήματα και σε στεάτωση σε πειραματικά μοντέλα, (2) ότι η απαλοιφή της ApoA-I σε ποντίκια που έχουν θραφεί με δίαιτα υψηλών λιπαρών οδηγεί σε στεάτωση και (3) ότι η ApoA-I συσσωρεύεται όταν παρεμποδίζεται η αυτοφαγία, υποθέσαμε ότι η ενδοκυττάρια ApoA-I θα μπορούσε φυσιολογικά να λειτουργήσει κατασταλτικά στην υπέρμετρη συγκέντρωση λιπιδίων και χοληστερόλης υπό συνθήκες αυτοφαγικής παρεμπόδισης. Πράγματι, βρήκαμε ότι η αποσιώπηση της ApoA-I σε κυτταρική σειρά ηπατοκυττάρων HepG2 συνεπάγεται την συσσώρευση μεγάλων λιπιδικών σταγόνων, ένα φαινόμενο το οποίο ενισχύθηκε από ταυτόχρονη παρεμπόδιση της αυτοφαγίας. Η δράση της ApoA-I στον έλεγχο του ενδοκυττάριου λιπιδικού φορτίου είναι ανεξάρτητη της αυτοφαγίας, καθώς η αποσιώπηση της ApoA-Ι δεν επηρέασε σημαντικά την αυτοφαγική ροή. Για να συγκεντρώσουμε πληροφορίες σχετικά με το μηχανισμό με τον οποίο η ApoA-I επηρεάζει τις ενδοκυττάριες λιπιδικές αποθήκες, διερευνήσαμε το μεταγράφωμα κυττάρων στα οποία έχει γίνει γενετική αποσιώπηση της ApoA-I. Η βιοπληροφορική ανάλυση κατέδειξε εμπλουτισμό βιολογικών διαδικασιών που σχετίζονται με το μεταβολισμό λιπιδίων και χοληστερόλης και συσχέτιση με τη νόσο του λιπώδους ήπατος και άλλων μεταβολικών νοσημάτων. Είναι ενδιαφέρον πως ένας σημαντικός αριθμός γονίδιων – σχετιζόμενων με τη βιογένεση λιπιδίων και χοληστερόλης – παρουσίασε αύξηση στην έκφραση και έπειτα από τη παρεμπόδιση της αυτοφαγίας αλλά και από τη γενετική αποσιώπηση της ApoA-I. Η συνδυαστική επίδραση οδήγησε σε μια αξιοσημείωτη αύξηση της γονιδιακής έκφρασης των μεταβολικών οδών σε σχέση με τις μεμονωμένες επιδράσεις. Οι παρατηρήσεις αυτές είναι σε συμφωνία με τη συσσώρευση λιπιδικών σταγόνων που προκύπτει από αυτές τις επιδράσεις, και υποστηρίζουν ότι η ενδοκυττάρια ApoA-I και η αυτοφαγία συγκλίνουν στο μεταγραφικό έλεγχο της de novo βιοσύνθεσης λιπιδίων και χοληστερόλης. Επιβεβαιωτικά πειράματα ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης που πραγματοποιήθηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες επιβεβαίωσαν ότι η μείωση των επιπέδων της ApoA-I σχετίζεται με την υπερέκφραση των γονιδίων βιοσύνθεσης λιπιδίων και χοληστερόλης. Η σημασία αυτών των ευρημάτων για τον άνθρωπο αναδεικνύεται από το γεγονός ότι η ανάλυση δεδομένων αλληλούχισης του μεταγραφώματος ιστών ασθενών με ηπατοκυτταρικό καρκίνο αποκάλυψε την ίδια συσχέτιση- δηλαδή ότι η έκφραση της ApoA-I είναι αντιστρόφως ανάλογη της έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση λιπιδίων και χοληστερόλης όπως τα HMGCR, HMGCS1, FASN, LPIN1 and ACACA. Ανάλυση της έκφρασης βασικών μεταγραφικών ρυθμιστών των γονιδίων που σχετίζονται με βιοσυνθετικά μονοπάτια λιπιδίων και χοληστερόλης υπό συνθήκες γενετικής αποσιώπησης της ApoA-I ή/και αυτοφαγικής παρεμπόδισης κατέδειξε ότι η παρεμπόδιση της αυτοφαγίας επηρεάζει την ωρίμανση του SREBP2 και όχι τη φωσφορυλίωση ή έκφραση του FOXO1/3. Αντίστροφα, η γενετική αποσιώπηση της ApoA-I οδήγησε σε αύξηση της φωσφορυλιωσης του FOXO1/3 αλλά δεν επιδρά στα επίπεδα και την πρωτεολυτική εκτομή του SREBP2. Αυτά τα ευρήματα είναι σε συμφωνία με την επίδραση της ApoA-I και της αυτοφαγίας στην αλλαγή των επιπέδων έκφρασης των μεταβολικών γονιδίων αλλά και στην ενίσχυση των δράσεων τους όταν συνυπάρχουν. Καθώς η φωσφορυλίωση του FOXO1/3 καθοδηγείται από την ενεργοποίηση της Akt, σε συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση της γενετικής αποσιώπησης της ApoA-I στο μονοπάτι σηματοδότησης της Αkt. Παρατηρήσαμε ότι η γενετική αποσιώπηση της ApoA-I οδηγεί σε εξαρτώμενη από mTORC2 φωσφορυλίωση της Akt στη σερίνη 473 και καταστολή του άξονα mTORC2/Αkt μειώνει την επίδραση της αποσιώπησης της ApoA-I στην έκφραση των HMGCR και ΗΜGCS1. Τα προκαταρκτικά αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η ApoA-I είναι σε φυσική αλληλεπίδραση τόσο με την Αkt1 όσο και με την Αkt2, τουλάχιστον όταν αυτά τα μόρια βρίσκονται σε συνθήκες υπερέκφρασης στη κυτταρική σειρά HEK293T. Επιπρόσθετες μελέτες χρειάζονται για τη διερεύνηση του μηχανισμού με τον οποίο η ApoA-I καθοδηγεί την ενεργοποίηση της Αkt. Πέρα από την αύξηση της έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με βιοσύνθεση λιπιδίων και χοληστερόλης, το μεταγράφωμα κυττάρων, τα οποία έχουν υποστεί ταυτόχρονα γενετική αποσιώπηση του γονίδιου της ApoA-I και παρεμπόδιση της αυτοφαγίας, είναι εμπλουτισμένα σε υποεκφραζόμενα γονίδια σχετιζόμενα με λειτουργίες ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και με νεοπλασματικές ασθένειες. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η μείωση της ApoA-I σε συνδυασμό με την παρεμπόδιση της αυτοφαγίας μπορεί να διαμορφώσει ένα κυτταρικό περιβάλλον αυξημένου λιπιδικού φορτίου και ένα δυναμικό ανεξέλεγκτου κυτταρικού πολλαπλασιασμού το οποίο θα μπορούσε να οδηγήσει σε κακοήθεις φαινοτύπους του ήπατος. Σε συμφωνία με αυτή τη θεωρία παρατηρήσαμε ότι η γενετική αποσιώπηση της ApoA1 σε ΗepG2 κύτταρα προστατεύει από την λιποτοξικότητα και την τοξικότητα από γενωμικό stress, ενώ παράλληλα παρέχει αντίσταση στο stress του ενδοπλασματικού δικτύου, όπως διαφαίνεται από την καταστολή της μεταγραφής των σχετικών γονιδίων. Εν κατακλείδι, τα προκαταρκτικά in vivo δεδομένα είναι σε συμφωνία με τα in vitro αποτελέσματα μας που καταδεικνύουν ότι η γενετική απαλοιφή της ApoA-I σε ποντίκια τα οποία έχουν ιστοειδική απαλοιφή του ATG5 στο ήπαρ οδηγεί σε επιδείνωση της παθολογίας στεάτωσης και μπορεί να καθοδηγήσει κακοήθεις φαινοτύπους του ήπατος. Συμπερασματικά, η ερευνά μας ρίχνει φως στη ρύθμιση της ApoA-I στο ήπαρ καθορίζοντας ένα κύριο μετα-μεταγραφικό μονοπάτι υπεύθυνο για τον έλεγχο των ενδοκυττάριων επιπέδων της. Κάτω από συνθήκες πλούσιων σε θρεπτικά η έκφραση της ApoA-I διατηρείται από την ισορροπιστική δράση της αυτοφαγίας και της εξαρτώμενης από mTORC1 de novo πρωτεϊνικής σύνθεσης. Επιπρόσθετα, αποκαλύψαμε ένα καινούριο ρόλο της ApoA-I στη ρύθμιση της λιπιδικής ομοιόστασης στο ήπαρ. Η ApoA-I φαίνεται να λειτουργεί ως φρένο στην αμετροεπή συσσώρευση λιπιδίων που προκύπτει από την αυτοφαγική παρεμπόδιση. Παρατηρήσαμε ότι η αυτοφαγική παρεμπόδιση, πέραν της γνωστής επίδρασης της μέσω της λιποφαγίας και της ρύθμισης λιπολυτικών μηχανισμών, επιδρά και στην επαγωγή της έκφρασης μεταβολικών γονιδίων στον καθορισμό του ενδοκυττάριου λιπιδικού φορτίου μέσω της ωρίμανσης του SREBP2. Η επίδραση της αυτοφαγικής παρεμπόδισης στη γονιδιακή έκφραση ενισχύεται από την γενετική αποσιώπηση της ApoA-I, η οποία διαμεσολαβείται από την εξαρτώμενη από την mTORC2 αύξηση της φωσφορυλίωσης της Akt και της συνεπακόλουθης φωσφορυλίωσης και απενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα FOXO1/3 που δρα ως καταστολέας της μεταγραφής μεταβολικών γονιδίων. Οι νέες λειτουργίες της ΑpoA-I που περιγράφονται στην παρούσα διδακτορική διατριβή είναι πιθανό να επαναδιαμορφώσουν την κατανόηση του μεταβολισμού των λιπιδίων και της χοληστερόλης αλλά και τον ρόλο της ίδιας της ApoA-I. Η διαφαινόμενη φυσική και λειτουργική αλληλεπίδραση της ApoA-I με την Akt, που διαμορφώνει το δυναμικό ενεργοποίησης της κινάσης και τη συνεπακόλουθη ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων που σχετιζονται με το μεταβολισμό λιπιδίων, χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη καταδεικνύει ότι τα ελαττωμένα επίπεδα της ApoA-I υπό συνθήκες παρεμπόδισης της αυτοφαγίας, όπως αυτές επικρατούν και στο ηπατοκυτταρικο καρκίνο, σχετίζονται με ενισχυμένη έκφραση γονιδίων σχετικά με τη βιοσύνθεση των λιπιδίων και της χοληστερόλης, με τη συσσώρευση λιπιδικών σταγόνων, με αυξημένη επιβίωσή in vitro, και με επιδείνωση καρκινογένεσης in vivo. Μελλοντικές έρευνες θα μπορούσαν να στοχεύσουν στην αποσαφήνιση του μηχανισμού με τον οποίο η ApoA-I φοσφωρυλιώνει την Akt, καθοδηγώντας και καθορίζοντας επιπρόσθετες κυτταρικές δράσεις, αλλά και στη συμμετοχή της ApoA-I στην αιτιοπαθολογία νόσων του ήπατος που σχετιζονται με αυξημένο λιπιδικό φορτίο και κακοήθεια.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
Apolipoprotein A-I (ApoA-I) is involved in reverse cholesterol transport as a major component of HDL, but also conveys anti-thrombotic, anti-oxidative, anti-inflammatory and immune-regulatory properties that are pertinent to its protective roles in cardiovascular, inflammatory and malignant pathologies. The aim of this PhD Thesis is to define post-transcriptional mechanisms responsible for the regulation of intracellular ApoA-I levels and decipher putative intracellular functions of ApoA-I, questions which remain poorly explored. Data presented in chapter 1 address the role of proteolytic pathways, autophagy and the ubiquitin-proteasome system (UPS) in ApoA-I regulation in hepatocytes and hepatoma cells as in vitro models to study the impact of genetic and chemical inhibitors of autophagy and the proteasome on ApoA-I by immunoblot, immunofluorescence and electron microscopy. Different growth conditions were implemented in conjunction with mTOR inhibitors to model the influence of nutri ...
Apolipoprotein A-I (ApoA-I) is involved in reverse cholesterol transport as a major component of HDL, but also conveys anti-thrombotic, anti-oxidative, anti-inflammatory and immune-regulatory properties that are pertinent to its protective roles in cardiovascular, inflammatory and malignant pathologies. The aim of this PhD Thesis is to define post-transcriptional mechanisms responsible for the regulation of intracellular ApoA-I levels and decipher putative intracellular functions of ApoA-I, questions which remain poorly explored. Data presented in chapter 1 address the role of proteolytic pathways, autophagy and the ubiquitin-proteasome system (UPS) in ApoA-I regulation in hepatocytes and hepatoma cells as in vitro models to study the impact of genetic and chemical inhibitors of autophagy and the proteasome on ApoA-I by immunoblot, immunofluorescence and electron microscopy. Different growth conditions were implemented in conjunction with mTOR inhibitors to model the influence of nutrient scarcity versus sufficiency on ApoA-I regulation. Hepatic ApoA-I expression was also evaluated in high fat diet-fed mice displaying blockade in autophagy. The results documented that under nutrient-rich conditions, basal ApoA-I levels are sustained by the balancing act of autophagy and of mTORC1-dependent de novo protein synthesis. Pharmacologic inhibition of autophagy and not the proteasome resulted in the accumulation of ApoA-I in hepatocytes. To dissect the molecular pathway that governs ApoA-I degradation by autophagy we used genetic silencing of key modulator of autophagic machinery and monitored ApoA-I levels. We found that ApoA-I proteolysis occurs via a canonical autophagic pathway involving Beclin1 and ULK1 and the receptor protein p62/SQSTM1 that targets ApoA-I to autophagosomes. We next analyzed ApoA-I levels, under conditions of starvation that induce autophagy and in parallel block anabolic processes as translation through mTOR pathway. We found that upon aminoacid insufficiency, suppression of ApoA-I synthesis prevails, rendering mTORC1 inactivation dispensable for autophagy-mediated ApoA-I proteolysis. Collectively, the data presented in chapter 1 underscore the major contribution of post-transcriptional mechanisms to ApoA-I levels which differentially involve mTORC1-dependent signaling to protein synthesis and autophagy, depending on nutrient availability. Given the established role of ApoA-I in HDL-mediated reverse cholesterol transport, this mode of ApoA-I regulation may reflect a hepatocellular response to the organismal requirement for maintenance of cholesterol and lipid reserves under conditions of nutrient scarcity. As hepatic expression of ApoA-I responds to nutrient availability, we were interested to explore whether ApoA-I may act as a mediator for specific cellular energetic requirements and as modulator of intracellular lipid metabolism under conditions of autophagic blockade and/or increased lipid load. Data presented in chapter 2 delineate the putative intracellular function of ApoA-I in the regulation of lipid metabolism. Intrigued by published evidence that, (1) suppression of autophagy leads to accumulation of large size lipid droplet (LD) in vitro and steatosis in vivo; (2) ApoA-I ablation in HFD-fed mice results in steatosis; and (3) ApoA-I accumulates in response to inhibition of autophagy, we hypothesized that intracellular ApoA-I may physiologically function to suppress lipid and cholesterol overload under conditions of autophagy blockade. Indeed, the knock-down of ApoA1 in the hepatoma cell line HepG2 resulted in the accumulation of large size lipid droplets, an effect that was amplified upon simultaneous inhibition of autophagy. This ApoA-I function was independent of autophagy, as ApoA-I depletion did not significantly affect autophagic flux. To provide mechanistic insights into the modulation of intracellular lipid stores by ApoA-I, we used a hypothesis-free approach that entails the unbiased interrogation of the transcriptome of ApoA-I depleted HepG2 cells. We identified enrichment of biological processes linked to lipid and cholesterol metabolism and an association with fatty liver and metabolic diseases. Interestingly, a significant number of genes related to cholesterol and lipid biosynthesis were commonly up-regulated by autophagy blockade and ApoA-I depletion which, when combined, led to a marked increase in metabolic gene expression compared to either treatment alone. These observations align with the LD accumulation ensued by these treatments and indicate that intracellular ApoA-I and autophagy converge to transcriptionally control de novo lipid and cholesterol biosynthesis. The significance of these findings in human disease is highlighted by our mining of hepatocellular carcinoma RNAseq data which confirmed that ApoA1 expression levels are inversely correlated with genes implicates in lipid and cholesterol biosynthesis, such as HMGCR, HMGCS, FASN, LPIN1 and ACACA.Expression analysis of key transcriptional modulators of lipid and cholesterol biosynthetic genes upon ApoA1 knock-down and/or autophagic inhibition revealed that inhibition of autophagy affects SREBP2 maturation but not FOXO1/3, whereas the RNAi-mediated depletion of ApoA1 leads to marked phosphorylation of FOXO1/3 but does not impact SREBP2 cleavage which is required to generate the transcriptionally active SREBP2. These findings align both with the impact of ApoA1 depletion and autophagy inhibition on inducing the expression of a common set of cholesterol and lipid biosynthesis genes and their amplifying effects on gene expression when combined. As FOXO1/3 phosphorylation is mediated by Akt activation, the effect of ApoA-I depletion on the Akt signaling pathway was examined. It was found that the knock-down of ApoA1 leads to mTORC2-dependent phosphorylation of Akt at Ser473 and that suppression of the mTORC2/Akt axis diminishes the effect of ApoA-I depletion on HMGCR and HMGCS1 expression. Our preliminary data demonstrate that ApoA-I physically interacts with both Akt1 and Akt2 at least when overexpressed in HEK293T cells. Further studies exploring the mechanism by which ApoA-I physiologically functions to moderate Akt activation are warranted. Beyond the upregulation of lipid and cholesterol biosynthesis processes, the transcriptome of dually ApoA-I depleted and autophagy-inhibited HepG2 cells is enriched in downregulated genes related to cell cycle control and an overall association with neoplastic diseases. We therefore hypothesize that the reduction in ApoA-I coupled with autophagy blockade, could provide a cellular environment of lipid overload with a pro-survival potential that could drive malignant phenotypes in the liver. In line with this notion, the knock-down of ApoA1 in HepG2 cells protects against lipotoxicity and genotoxicity, and in parallel provides ER-stress resistance as indicated by the transcriptional suppression of genes involved in lipid overload-mediated ER stress, facilitating cell survival. Finally, our preliminary in vivo data, in accordance with our in vitro results, demonstrate that ApoA-I ablation in mice with liver specific ablation of ATG5 exaggerates steatosis and carcinogenic phenotypes.Collectively, our study sheds light into the regulation of hepatic ApoA-I by defining a major post-transcriptional pathway responsible for the control of intracellular ApoA-I levels. Under nutrient-rich conditions, ApoA-I expression is sustained by the balancing acts of basal autophagy and of mTORC1-dependent de novo protein synthesis. In contrast, upon aminoacid insufficiency, suppression of ApoA-I synthesis prevails, rendering mTORC1 inactivation dispensable for autophagy-mediated ApoA-I proteolysis. In addition, we unveil a novel role for ApoA-I in hepatic lipid homeostasis. ApoA-I functions as a break to lipid accumulation which is particularly evident under conditions of autophagic inhibition. We also found that autophagy blockade, besides its direct involvement in the regulation of intracellular lipid stores through lipophagy and modulation of lipolytic mechanisms, acts in the transcriptional regulation of cholesterol and fatty acid biosynthetic gene expression by affecting SREBP2 maturation. The effect of autophagy inhibition on gene expression is augmented by ApoA1 knock-down which induces mTORC2-dependent Akt phosphorylation inactivating the transcription factor FOXO1/3, a negative regulator of lipid and cholesterol biosynthesis genes. The novel intracellular functions of ApoA-I identified in this PhD Thesis are likely to transform our understanding of lipid and cholesterol metabolism and expand our understanding of the in vivo physiological roles of ApoA-I. The identification of ApoA-I as a novel putative Akt-interacting protein, once consolidated with additional experiments, will also expand our knowledge of this key kinase in different tissues. Results in this PhD Thesis also demonstrate that reduced levels of ApoA-I under conditions of autophagy inhibition, as observed in hepatocellular carcinoma, are associated with amplified lipid and cholesterol biosynthetic gene expression, lipid droplet accumulation, enhanced survival in vitro and exaggerated hepatocarcinogenesis in vivo. Future studies will aim at dissection of the mechanism of ApoA-I modulation of Akt phosphorylation and provide further insights into the implication of ApoA-I regulation in liver pathologies associated with increased lipid load and carcinogenesis.
περισσότερα