Genome-wide association analysis and gene network analysis for (re)production traits in commercial broilers

Abstract

Aim of the present PhD thesis was to identify genetic variants and plausible functional genes for two typical polygenic traits in broilers, one related to growth (body weight at 35 days of age, BW) and the other with reproduction efficiency (number of eggs per female broiler, EN). To this end, numerous genome-wide association studies (GWAS) were conducted to detect marker-trait associations and various post-GWAS in silico methods were applied in efforts to discover (novel) functional candidate genes for individual and joint traits.Chapter 1 presents an optimal sampling strategy when conducting cost-effective GWASs. To this end, 19 GWASs for BW were conducted using random and extreme phenotype (continuous and dichotomized) samples with sizes ranging from 5% to 50% of a total population of 6700 broilers. The most efficient sampling scenario was identified by comparing genome-wide significant marker signals between sub-samples and the whole population. This comparison pointed out 50% extreme phenotype sampling as the optimal sampling scenario. In the optimal sampling scenario, putative genetic variants were selected using a threshold of 1% for the Proportion of Variance Explained associated with markers. This search strategy resulted in identification of a total number of five putative causal genetic variants. These variants resided in genomic regions harboring ten growth-related QTLs (e.g. breast muscle percentage, abdominal fat weight etc.) and six growth related genes (CACNB1, MYOM2, SLC20A1, ANXA4, FBXO32, SLAIN2). Chapter findings proposed the use of 50% extreme phenotype sampling as the optimal sampling strategy to detect causative genes when performing cost-effective GWASs. Chapter 2 investigates the utility of various computational (in silico) techniques to propose functional candidate genes for BW. First, a GWAS for BW was conducted to detect significant marker-trait associations. This analysis pointed out twelve genome-wide significant SNPs across nine autosomes. The search for positional candidate genes in 1 Mb flanking regions around the significant markers revealed a total number of 1,012 candidate genes and 197 growth-related QTL/associations. Implementation of Functional Enrichment Analysis (FEA), Pathway Analysis (PA), Gene Network Analysis (GNA) and Gene functional Prioritization Analysis (GPA) to predict functional relevance of the candidate genes followed. FEA pointed out 49 candidate genes participating in system development while PA highlighted 25 member genes in growth-related pathways. GPA and GNA pointed out 14 common genes (UBC, SMAD4, SHC1, NRAS, PSMD4, CDC6, PSMD7, RARA, PSMB4, CDH1, STAT5B, MED1, PSMD3 and CDT1) with highest functional relevance to the trait under study. Application of the preceding computational methods has, individually or jointly, demonstrated that extant knowledge and available tools can be useful to prioritize most likely candidates for traits under investigation. In Chapter 3, the functional role of modular genes (genes organized into dense sub-networks) was explored in efforts to identify causal genes for BW. To this end, first a GWAS for BW was carried out. Then, genomic regions around the significant SNPs showing strong linkage disequilibrium levels (D′>0.8) were searched to identify positional candidate genes and reported QTLs for the trait. This search revealed a total number of 645 positional candidate genes around 11 genome-wide significant markers. Community structure analysis was then conducted to detect densely interconnected nodes (modules) of the positional candidate genes. This analysis detected five modules formed by 401 candidate genes. Functional enrichment analysis of the modular genes showed 52 genes as participating in developmental processes. 14 more modular genes (GABRG1, NGF, APOBEC2, STAT5B, STAT3, SMAD4, MED1, CACNB1, SLAIN2, LEMD2, ZC3H18, TMEM132D, FRYL and SGCB) had evidenced growth functional relevance. In the present Chapter, a total number of 66 functional candidate genes for BW were proposed, some of which were novel and some identified in previous studies. Chapter 4 aimed to provide the genetic variants impacting on egg number (EN) in female broilers. To this end, additive and dominant genetic models were applied to detect trait-marker associations. This analysis resulted in identification of a total number of 17 chromosome-wide significant markers. Of these, 7 were additive, 4 dominant and 6 additive plus dominant. Degree of dominance for the purely dominant markers ranged from partial to complete dominance. A total number of 57 positional candidate genes were identified within 50 kb flanking regions around the significant markers. Functional enrichment analysis of the positional candidate genes pinpointed two genes (BHLHE40 and CRTC1) to be involved in the ‘entrainment of circadian clock by photoperiod’ biological process. Gene prioritization analysis of the positional candidate genes identified ten top ranked genes (GDF15, BHLHE40, JUND, GDF3, COMP, ITPR1, ELF3, ELL, CRLF1 and IFI30). Seven prioritized genes (GDF15, BHLHE40, JUND, GDF3, COMP, ELF3, CRTC1) had documented functional relevance to reproduction, while two more prioritized genes (ITPR1 and ELL) are reported to be related to egg quality in female chickens.Chapter 5 aimed to shed light in the genetic mechanism underlying the antagonistic (negative) genetic correlation between growth (BW) and reproduction (EN) in broilers. First, a bivariate marker-traits association analysis was performed. This analysis resulted in detection of a total number of 51 genome-wide significant markers across 21 autosomes. Application of stepwise conditional-joint analyses pinpointed a total number of 13 independent markers. These independent markers were located within 17 reported QTLs and within or close proximity to 14 positional candidate genes. Examination of the Gene Ontology (GO) Biological Process (BP) profile per candidate gene highlighted two genes (ACVR1 and CACNA1H) that were participating in relevant BPs to the traits under study. Of these genes, ACVR1 was directly involved in both developmental and reproductive processes while CACNA1H was directly participating in reproduction and indirectly in growth via metabolic processes. Literature evidence of the functions of the two aforementioned genes (ACVR1 and CACNA1H) enhanced their candidacy as pleiotropic genes for the examined traits and set them as typical gene exemplars of horizontal pleiotropy. Chapter findings provide novel insight in the nature of the antagonistic co-variation between growth and reproduction in female broilers.

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν ο εντοπισμός γενετικών δεικτών και υποψηφίων γονιδίων που εμπλέκονται στο γενετικό έλεγχο δύο τυπικών πολυγονιδιακών ιδιοτήτων σε κρεοπαραγωγικά ορνίθια. Μία ιδιότητα σχετίζεται με την ανάπτυξη (σωματικό βάρος στις 35 ημέρες, ΣΒ) και η άλλη με την αναπαραγωγική ικανότητα (αριθμός αυγών ανά όρνιθα, ΑΩ). Για το σκοπό αυτό, διεξάχθηκαν γονιδιωματικής κλίμακας αναλύσεις συσχέτισης (GWAS) δεικτών-φαινοτυπικών τιμών και χρησιμοποιήθηκαν διάφορα εργαλεία Βιοπληροφορικής για τον εντοπισμό υποψηφίων λειτουργικών γονιδίων που επηρεάζουν έκαστη ή και τις δύο ιδιότητες, ταυτόχρονα. Στο Κεφάλαιο 1 περιγράφεται η βέλτιστη στρατηγική δειγματοληψίας για τον εντοπισμό υπευθύνων γενετικών δεικτών και γονιδίων όταν λόγω περιορισμένων οικονομικών πόρων δεν είναι δυνατή η γονοτύπηση του συνόλου των ατόμων ενός πληθυσμού. Ειδικότερα, εξετάστηκε η αποτελεσματικότητα εναλλακτικών σεναρίων τα οποία περιελάμβαναν τυχαία υποσύνολα καθώς και υποσύνολα ακραίων φαινοτύπων μεγέθους 5% έως 50% ενός συνολικού πληθυσμού 6.700 ορνιθίων κρεοπαραγωγής. Το πιο αποτελεσματικό σενάριο δειγματοληψίας προσδιορίστηκε συγκρίνοντας τους στατιστικώς σημαντικούς δείκτες μεταξύ των υποσυνόλων και ολόκληρου του πληθυσμού. Στο βέλτιστο σενάριο, η αναζήτηση των πλέον πιθανών υποψηφίων δεικτών για την ιδιότητα βασίστηκε στο ποσοστό της φαινοτυπικής διακύμανσης που αυτοί εξηγούν χρησιμοποιώντας ένα κατώτερο όριο της τάξεως του 1%. Ως βέλτιστο σενάριο δειγματοληψίας αναδείχθηκε η χρησιμοποίηση του ημίσεος του συνολικού πληθυσμού το οποίο περιλαμβάνει ακραίες (υψηλές και χαμηλές) φαινοτυπικές τιμές για την ιδιότητα. Στο σενάριο αυτό, εντοπίστηκαν συνολικά πέντε δείκτες οι οποίοι εδράζουν εντός ή εγγύς έξι γονιδίων (CACNB1, MYOM2, SLC20A1, ANXA4, FBXO32, SLAIN2) και δέκα δημοσιευμένων ποσοτικών γονιδιακών τόπων (QTLs) σχετιζόμενων με την ανάπτυξη. Τα παρόντα ευρήματα έδειξαν ότι υπό συνθήκες περιορισμένων πόρων, η διεξαγωγή GWAS με το ήμισυ του πληθυσμού το οποίο περιλαμβάνει ακραίους φαινοτύπους για την ιδιότητα συνιστά μια αποτελεσματική στρατηγική για τον εντοπισμό υποψηφίων γονιδίων. Στο Κεφάλαιο 2 διερευνάται η χρησιμότητα διαφόρων βιοπληροφορικών εργαλείων κατά την αναζήτηση λειτουργικών γονιδίων για ποσοτικές ιδιότητες όπως το ΣΒ. Αρχικά διεξήχθηκε ανάλυση συσχέτισης γενωμικών δεικτών-φαινοτυπικών τιμών για την ιδιότητα. Η ανάλυση αυτή ανέδειξε 12 στατιστικώς σημαντικούς δείκτες σχετιζόμενους με την ιδιότητα. Ακολούθησε αναζήτηση δημοσιευμένων ποσοτικών γονιδιακών τόπων (QTLs) και υποψηφίων γονιδίων εντός γενωμικών περιοχών εύρους 1 Mb γύρω από τους στατιστικώς σημαντικούς δείκτες. Η αναζήτηση αυτή ανέδειξε 1012 υποψήφια γονίδια θέσεως και 197 δημοσιευμένους QTLs σχετιζόμενους με την ανάπτυξη. Ακολούθησε λειτουργική ανάλυση (Functional Enrichment Analysis, FEA), ανάλυση ατραπών (Pathway Analysis, PA), τοπολογική ανάλυση δικτύου γονιδίων (Gene Network Analysis, GNA) και ανάλυση λειτουργικής προτεραιοποίησης (Gene functional Prioritization Analysis, GPA) με σκοπό την πρόβλεψη του λειτουργικού ρόλου των υποψηφίων γονιδίων. Η λειτουργική ανάλυση των υποψηφίων γονιδίων ανέδειξε 49 γονίδια ως εμπλεκόμενα σε αναπτυξιακές διαδικασίες ενώ 25 γονίδια βρέθηκαν να συμμετέχουν σε βιολογικές ατραπούς σχετιζόμενες με την ανάπτυξη. Η τοπολογική ανάλυση δικτύου γονιδίων και η ανάλυση λειτουργικής προτεραιοποίησης ανέδειξαν 14 κοινά γονίδια (UBC, SMAD4, SHC1, NRAS, PSMD4, CDC6, PSMD7, RARA, PSMB4, CDH1, STAT5B, MED1, PSMD3, CDT1) ως πλέον σχετιζόμενα με την ιδιότητα. Η εφαρμογή των παραπάνω μεθόδων, είτε μεμονωμένα είτε συνδυαστικά, έδειξε ότι οι υπάρχουσες γνωσιακές βάσεις και τα διαθέσιμα εργαλεία μπορούν να συνεισφέρουν αποτελεσματικά στον εντοπισμό λειτουργικών γονιδίων για τις εξεταζόμενες ιδιότητες. Στο Κεφάλαιο 3 επιχειρήθηκε ανίχνευση δομών (modules) για τα υποψήφια γονίδια θέσεως και ακολούθως ανάλυση του λειτουργικού τους ρόλο με σκοπό τον εντοπισμό πλέον πιθανών γονιδίων για την ιδιότητα ΣΒ. Αρχικά, διενεργήθηκε γενωμική ανάλυση δεικτών-φαινοτυπικών τιμών. Ακολούθησε αναζήτηση δημοσιευμένων ποσοτικών γονιδιακών τόπων (QTLs) και γονιδίων θέσεως εντός γενωμικών περιοχών με υψηλά επίπεδα ανισορροπίας σύνδεσης (D′>0.8) γύρω από τους στατιστικώς σημαντικούς δείκτες. Η αναζήτηση αυτή ανέδειξε 645 υποψήφια γονίδια θέσεως γύρω από 11 στατιστικώς σημαντικούς δείκτες. Ακολούθησε εντοπισμός δομών εντός του δικτύου των υποψηφίων γονιδίων. Η ανάλυση αυτή ανέδειξε 5 δομές σχηματιζόμενες από 401 υποψήφια γονίδια. Η λειτουργική ανάλυση των γονιδίων που συνθέτουν τις παραπάνω δομές ανέδειξε 52 γονίδια ως συμμετέχοντα σε αναπτυξιακές διαδικασίες ενώ άλλα 14 γονίδια (GABRG1, NGF, APOBEC2, STAT5B, STAT3, SMAD4, MED1, CACNB1, SLAIN2, LEMD2, ZC3H18, TMEM132D, FRYL, SGCB) είχαν αποδεδειγμένα λειτουργικούς ρόλους σχετιζόμενους με την ανάπτυξη. Συνολικά, οι παραπάνω αναλύσεις ανέδειξαν 66 λειτουργικά γονίδια για την ιδιότητα, κάποια από τα οποία ήταν νέα και κάποια ήδη γνωστά. Στο Κεφάλαιο 4 διεξήχθησαν αναλύσεις συσχέτισης γενωμικών δεικτών-φαινοτυπικών τιμών με σκοπό τον εντοπισμό δεικτών που ασκούν προσθετικές ή/και κυριαρχικές επιδράσεις στην αναπαραγωγική ικανότητα (ΑΩ) των ορνίθων κρεοπαραγωγής. Ακολούθησε ποσοτική διερεύνηση του τρόπου δράσης των δεικτών και εντοπισμός υποψηφίων γονιδίων για την ιδιότητα. Συνολικά, εντοπίσθηκαν 17 στατιστικώς σημαντικοί δείκτες σε επίπεδο χρωμοσώματος εκ των οποίων 7 σχετίστηκαν με προσθετικής φύσεως, 4 με κυριαρχικές και 6 και με τις δύο μορφές επιδράσεων (προσθετικές και κυριαρχικές). Ειδικότερα, οι 4 δείκτες κυριαρχίας σχετίστηκαν με φαινόμενα μερικής έως πλήρους κυριαρχίας. Η αναζήτηση υποψηφίων γονιδίων εντός γενωμικών περιοχών 50 kb γύρω από τους στατιστικώς σημαντικούς δείκτες κατέδειξε συνολικά 57 υποψήφια γονίδια θέσεως. Η ανάλυση λειτουργικής ενίσχυσης των υποψηφίων γονιδίων έδειξε ότι δύο από αυτά (BHLHE40 και CRTC1) εμπλέκονται σε μηχανισμούς ανάδρασης του βιολογικού (cicardian) ρυθμού των πτηνών μέσω της φωτοπεριόδου. Επιπλέον, η ανάλυση λειτουργικής προτεραιοποίησης ανέδειξε επτά γονίδια (GDF15, BHLHE40, JUND, GDF3, COMP, ELF3, CRTC1) ως σχετιζόμενα με την αναπαραγωγή και δύο επιπλέον (ITPR1, ELL) με ποιοτικές ιδιότητες του αυγού. Συνολικά, τα ευρήματα του 4ου Κεφαλαίου υπογραμμίζουν τη σημασία και των μη προσθετικής φύσεως επιδράσεων στο γενετικό έλεγο της αναπαραγωγικής ικανότητας στις κρεοπαραγωγικές όρνιθες προτείνοντας παράλληλα νέα γονίδια για την ιδιότητα. Στο Κεφάλαιο 5 αναζητήθηκαν οι υπεύθυνοι μηχανισμοί για την παρατηρούμενη αρνητική γενετική συσχέτιση (rG=-0,17) μεταξύ τoυ σωματικού βάρους (ΣΒ) και της ωοπαραγωγικής ικανότητας (ΑΩ) σε κρεοπαραγωγές όρνιθες. Αρχικά, εφαρμόστηκε διμεταβλητή ανάλυση συσχέτισης γενωμικών δεικτών - φαινοτυπικών τιμών για τις δύο ιδιότητες. Η ανάλυση αυτή ανέδειξε 51 σημαντικούς δείκτες εκ των οποίων οι 13 ήταν ανεξάρτητοι (περιοχές με χαμηλά επίπεδα ανισορροπίας σύνδεσης). Ακολούθησε αναζήτηση δημοσιευμένων ποσοτικών γονιδιακών τόπων (QTLs) και υποψηφίων γονιδίων θέσεως που περιλάμβαναν τους ανεξάρτητους δείκτες. Η αναζήτηση αυτή οδήγησε στον εντοπισμό 17 δημοσιευμένων ποσοτικών γονιδιακών τόπων (QTLs) και 14 υποψηφίων γονιδίων θέσεως. Ακολούθησε εξέταση των βιολογικών διεργασιών ανά υποψήφιο γονίδιο, η οποία ανέδειξε δύο γονίδια (ACVR1, CACNA1H) ως συμμετέχοντα σε αναπτυξιακές και αναπαραγωγικές βιολογικές διεργασίες. Ειδικότερα, το γονίδιο ACVR1 εμπλέκονταν άμεσα στην ανάπτυξη και στην αναπαραγωγή, ενώ το γονίδιο CACNA1H συμμετείχε άμεσα σε αναπαραγωγικές και έμμεσα σε αναπτυξιακές μεταβολικές λειτουργίες. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, τα δύο προαναφερθέντα γονίδια παρουσίασαν τεκμηριωμένη εμπλοκή σε αναπτυξιακές και αναπαραγωγικές βιολογικές λειτουργίες μέσω της συμμετοχής τους σε διάφορες βιοχημικές ατραπούς. Τα ευρήματα του παρόντος Κεφαλαίου συνεισφέρουν στην βαθύτερη κατανόηση του γενετικού μηχανισμού που ευθύνεται για την αρνητική γενετική συσχέτιση μεταξύ της ανάπτυξης και της αναπαραγωγής στα ορνίθια κρεοπαραγωγής, προτείνοντας υποψήφιους γενωμικούς δείκτες και γονίδια με πλειοτροπική δράση.