Επίδραση της αίμης στο φλεγμονώδες μικροπεριβάλλον των νεοπλασματικών κυττάρων: αναζήτηση μοριακών στόχων: αναζήτηση μοριακών μηχανισμών σηματοδότησης της ελεύθερης αίμης/αιμίνης και προστασία κυτταροτοξικότητας από θειόλες

Abstract

Heme (iron protoporphyrin IX), as the prosthetic group in several hemoproteins, regulates vital cellular functions in human tissues. However, in hemolytic disorders cytotoxic free heme released from damaged RBCs affects multiple organs in millions of individuals worldwide. Heme induces its metabolic degradation via heme oxygenase-1 (HO-1), activated by NF-E2-related factor 2 (NRF2), the master stress response transcription factor. The precise mechanism through which heme as a signaling molecule, activates NRF2 is not well understood. Human pro-erythroid K562 cells responding to hemin (ferric chloride heme), were employed to investigate the hemin-induced cytotoxicity (HIC), at ≥50 μM and explore the activation of Kelch-like ECH-associated protein 1 (KEAP1)/NRF2 stress response and anti-inflammatory signaling pathway. The intracellular pools of hemin were found to regulate the progression from the reversible cell growth inhibition to non-apoptotic cell death of K562 cells. Hemin-induced accumulation of both reactive oxygen species (ROS) and ubiquitinylated proteins disturbed cellular proteostasis. Hemin activated the NRF2 transcription factor, through protein stabilization and nuclear translocation, while failed to do so for the NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)- pro-inflammatory pathway (as assessed via p65 nuclear translocation and expression of main pro-inflammatory genes). The NRF2-driven genes encoding glutamate-cysteine ligase (GCLC) and cystine/glutamate antiporter (xCT) were substantially activated. Mechanistically, hemin stabilized NRF2 protein levels selectively by inhibiting the KEAP1-driven ubiquitination of NRF2, while allowing KEAP1 ubiquitination. High-molecular-weight ubiquitinylated KEAP1 variants formed in hemin-treated cells were degraded in proteasomes, while a portion of them translocated into the nucleus. Moreover, hemin promoted induction of CXCL8, CXCL1 and CXCL2 via stabilization of their labile RNA transcripts. Although for years it was known that thiols like glutathione (GSH) antagonize heme/hemin cytotoxicity without knowing how, we were able to uncover the underlying molecular mechanism by which N-acetylcysteine (NAC), a well-known thiol, prevents hemin-induced cytotoxicity (HIC). NAC inhibited the intracellular accumulation of hemin and prevented hemin-induced cell growth inhibition, cell death, oxidative stress, and accumulation of ubiquitinylated proteins. Meanwhile, the activation of the NRF2-driven stress gene activation and the induction of CXCL8 were suppressed by NAC. A refined selective mechanism of chemical reaction between NAC and hemin leading to adduct formation via a nucleophilic attack on hemin was discovered for the first time as documented by tandem mass spectrometry analysis (LC-MS/MS). Analogous GSH-hemin adducts were also detected, implying that thiol-hemin adducts act as intermediates to mitigate HIC and suppress hemin-induced NRF2-driven gene activation and induction of CXC chemokines. Our findings strongly support the concept that NAC-hemin adduct formation is the major novel molecular mechanism involved rather the capacity of thiols to encounter HIC via ROS-scavenging. Overall, this study depicts that the activation of KEAP1/NRF2 signaling pathway and the induction of CXC chemokines genes post-transcriptionally by free heme/hemin are considered basic homeostatic mechanisms, activated in cells both in healthy and diseased state. Their activation provides a multi-target platform to develop novel agents preventing HIC.

Η αίμη (σύμπλοκο σιδήρου και πρωτοπορφυρίνης IX), επιτελεί σημαντικές ζωτικές λειτουργίες στον άνθρωπο, ως προσθετική ομάδα των αιμοπρωτεϊνών. Ωστόσο, στις αιμολυτικές παθήσεις, που αφορούν εκατομμύρια ανθρώπων παγκοσμίως, η κυτταροτοξική αίμη που απελευθερώνεται από τα καταστραμμένα RBCs επιδρά σε διάφορα όργανα. Η αίμη επάγει τον καταβολισμό της, μέσω της οξυγενάσης της αίμης-1 (HO-1), που ελέγχεται από τον NF-E2-σχετιζόμενο παράγοντα 2 (NRF2), τον κύριο μεταγραφικό παράγοντα που αποκρίνεται στο οξειδωτικό στρες. Ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο η αίμη σηματοδοτεί επί του NRF2 δεν είναι γνωστός. Τα Κ562, που αποτελούν ανθρώπινα πρόδρομα ερυθροκύτταρα, που αποκρίνονται στην αιμίνη (οξειδωμένη αίμη), χρησιμοποιήθηκαν ως μοντέλο για να διερευνηθεί η επαγόμενη από την αιμίνη κυτταροτοξικότητα (HIC), σε συγκεντρώσεις ≥50 μM και η ενεργοποίηση του Kelch-like ECH-associated protein 1 (KEAP1)/NRF2 αντιοξειδωτικού και αντιφλεγμονώδους σηματοδοτικού μονοπατιού. Η ενδοκυττάρια συσσώρευση της αιμίνης βρέθηκε να ρυθμίζει την πρόοδο από την αντιστρεπτή αναστολή της ανάπτυξης στον μη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο των Κ562 κυττάρων. Η αιμίνη προκάλεσε τη συσσώρευση δραστικών ριζών οξυγόνου (ROS) και ουβικουιτινυλιωμένων πρωτεϊνών, οδηγώντας σε διαταραχή της κυτταρικής πρωτεοστασίας. Παράλληλα, η αιμίνη ενεργοποίησε τον NRF2 μεταγραφικό παράγοντα, μέσω σταθεροποίησης σε πρωτεϊνικό επίπεδο και πυρηνικής μετατόπισης, ενώ δεν ενεργοποίησε το NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)- προ-φλεγμονώδες μονοπάτι (πυρηνική μετατόπιση της p65 υπομονάδας και έκφραση κύριων προ-φλεγμονωδών γονιδίων). Η έκφραση των δύο NRF2-ρυθμιζόμενων γονίδιων, που κωδικοποιούν την λιγάση γλουταμικού-κυστεΐνης (GCLC) και τον αντι-μεταφορέα κυστίνης-γλουταμικού (xCT), ενεργοποιήθηκε σημαντικά. Μηχανιστικά, η αιμίνη σταθεροποίησε τα πρωτεϊνικά επίπεδα του NRF2, αναστέλλοντας την KEAP1-μεσολαβούμενη ουβικουιτινυλίωση του NRF2, και επάγοντας την ουβικουιτινυλίωση του KEAP1. Οι ουβικουιτινυλιωμένες πρωτεϊνικές μορφές του KEAP1, μεγάλων μοριακών μαζών, που σχηματίστηκαν στα κύτταρα που επωάσθηκαν με αιμίνη, διασπάστηκαν στο πρωτεάσωμα, ενώ ένα ποσοστό αυτών ανιχνεύτηκε και στον πυρήνα. Επιπλέον, η αιμίνη αύξησε την έκφραση των CXCL8, CXCL1 and CXCL2 μέσω της σταθεροποίησης των βραχύβιων μεταγράφων των γονιδίων αυτών. Παρά το γεγονός ότι οι θειόλες, όπως η γλουταθειόνη (GSH) είναι γνωστό ότι ανταγωνίζονται την HIC, δεν ήταν γνωστός ο μοριακός μηχανισμός. Χρησιμοποιώντας την N-ακετυλοκυστεΐνη (NAC), μία φαρμακευτική θειόλη, διαλευκάνθηκε ο μηχανισμός της προστασίας από την HIC. Το NAC ανέστειλε την ενδοκυττάρια συσσώρευση της αιμίνης και τα επαγόμενα από την αιμίνη κυτταρικά γεγονότα, αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, κυτταρικό θάνατο, οξειδωτικό στρες, και συσσώρευση ουβικουιτινυλιωμένων πρωτεϊνών. Επίσης, η ενεργοποίηση του NRF2-επαγόμενου σηματοδοτικού μονοπατιού και η επαγωγή του CXCL8 αναστάλθηκαν από το NAC. Με τη τεχνολογία της εν σειράς φασματομετρίας μάζας (LC-MS/MS) αποδείχθηκε για πρώτη φορά ένας ειδικός μηχανισμός που περιλάμβανε τη χημική αντίδραση μεταξύ του NAC και της αιμίνης, όπου μετά από νουκλεόφιλη προσβολή δημιουργήθηκαν ομοιοπολικά προϊόντα σύζευξης (NAC-hemin adducts). Ανάλογα, GSH-hemin adducts επίσης ανιχνεύτηκαν, υποδηλώνοντας ότι τα thiol-hemin adducts μεσολάβησαν στην αναχαίτιση της HIC και στην αναστολή της NRF2-μεσολαβούμενης απάντησης και επαγωγής των CXC χημειοκινών. Συμπερασματικά, η μελέτη αυτή απέδειξε ότι η ενεργοποίηση του KEAP1/NRF2 σηματοδοτικού μονοπατιού και η επαγωγή των CXC χημειοκινών σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο από την ελεύθερη αίμη/αιμίνη αντιπροσωπεύουν ομοιοστατικούς μηχανισμούς που ενεργοποιούνται σε παθοφυσιολογικές διαταραχές από την έκθεση στην κυτταροτοξική ελεύθερη αίμη/αιμίνη. Η ενεργοποίηση των μονοπατιών αυτών θα μπορούσε να αποτελεί πλατφόρμα για την ανάπτυξη παραγόντων/θεραπευτικών αναχαίτισης της HIC.