Development of analytical methods for the HPLC-based determination of sulfonamides after microextraction with novel (nano)materials

Abstract

Antibiotics are well-known for their theraceutical applications. However, in the last years, their presence in the environment and food products has raised concerns. To address theissue, regulatory agencies have set maximum residue limits for most of them. Sulfonamides (SAs) are the first class of commercially available antibiotics and among the most commonly used ones. This is the reason why many analytical methods are being developed for SAs detection. In this Ph.D. thesis, four new sorbents ((nano)materials) are developed and utilized in sample preparation procedures, to extract SAs from food and environmental matrices and as a consequence, four analytical methods are developed. SAs were separated using an HPLC system and detected/quantified using a diode array detector. The sulfonamides employed are: sulfacetamide, sulfathiazole, sulfadiazine, sulfapyridine, sulfamerazine, sulfamethazine, sulfamethoxypyridazine, sulfachloropyridazine, sulfamethoxazole, sulfadimethoxine, sulfisoxazole and sulfaquinoxaline. In the first method, melamine sponges are functionalized with graphene (GMeS) and used as an adsorbent. The sponges are prepared by an easy, one-step procedure, which complies with the principles of green chemistry and is proved advantageous over previously described synthesis methods. The applicability of the GMeS in extraction procedures is studied and an analytical method for the determination of sulfonamides in milk, eggs and lake water is developed and validated according to SANCO/12571/2013 guideline. The method is highly accurate and reproducible, while the limits of quantification are found to be fairly low (0.31-0.91 μg/kg, 0.96-1.32 μg/kg and 0.10-0.29 μg/L in the case of milk, eggs and lake water, respectively). Furthermore, the method is exempt from matrix effects, since the microextraction procedure serves not only as such but also as a clean-up step. Some additional advantages of the proposed procedure are the low cost and environmentally friendly synthesis, efficiency and the high extraction recoveries. In the second study, the modification/loading of melamine sponge with metallic copper sheets (CuMeS) is discussed. The CuMeS is prepared in a fast, single-step procedure, where the concurrent production of copper oxides is avoided. The as-prepared CuMeS is utilized to develop a sensitive and selective sample preparation procedure to extract SAs from milk and water samples. The surface of the resulting CuMeS, after drying is rendered hydrophobic enabling hydrophobic interactions with analytes. This is the first time that the benefits of the high affinity of copper for SAs are reaped for analytical purposes. Due to the high selectivity for SAs, the proposed CuMeS-based procedure acts both as an extraction and a clean-up step for their quantitative determination. The analytical method developed, which is based on the extractive potential of CuMeS, has the merits of wide linearity (including concentrations above and below the maximum residue limit of SAs), low limits of quantification (0.025–0.057 μg/L for lake water and 0.23–1.05 μg/L for milk samples), high enrichment factors and highly satisfactory recoveries and repeatability. The analytical method is validated according to the Commission Decision 657/2002/EC.With respect to the third method, an enhanced variant of magnetic ionic liquid (MIL)-based dispersive liquid-liquid microextraction is put forward. The procedure combines a water-insoluble solid support and the [P66614+][Dy(III)(hfacac)4-] MIL, in a one-pot, pHmodulated procedure for the microextraction of triazines (TZs) and SAs. The solid supporting material is mixed with the MIL to overcome difficulties concerning the weighing of MIL and to control the uniform dispersion of the MIL, rendering the whole extraction procedure more reproducible. The pH-modulation during the extraction step enables the one-pot extraction of SAs and TZs, from a single sample, in 15 min. Overall, the new analytical method developed enjoys the benefits of sensitivity (limits of quantification: 0.034-0.091 μg/L) and precision (relative standard deviation: 5.2-8.1%), while good recoveries (i.e., 89-101%) are achieved from lake water and effluent from a municipal wastewater treatment plant. Owing to all of the above, the new procedure can be used to determine the concentrations of SAs and TZs at levels below the maximum residue limits. Finally, for the development of the last method, zinc ferrites were used in a magnetic, ultrasound-assisted dispersive micro solid-phase procedure. Although zinc is known to have a high affinity for sulfonamides, there are no sample preparation procedures based on this property. The synthesis of zinc ferrites is straightforward, and the resulting materials exhibit favorable magnetic properties for their harvesting after extraction. Zinc ferrites can efficiently and selectively extract SAs from lake water and egg samples. The new procedure exhibits low limits of quantification (0.06 up to 0.11 μg/L), low matrix effect (from -8% to 8%), acceptable recoveries (88-101%) and satisfactory enrichment factors (111-141). Moreover, the method has a wide linear range (up to 250 μg/L) making it possible the determination of sulfonamides at concentrations above or below the maximum residue limit. Due to the aforementioned merits as well as the simplicity, the few synthetic steps required and the efficiency of sample preparation, the developed method can be used for routine analysis of sulfonamides.

Τα αντιβιοτικά είναι ευρέως διαδεδομένα για τις θεραπευτικές τους ιδιότητες. Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια εκφράζονται ανησυχίες σχετικά με την ύπαρξή τους στο περιβάλλον και στα τρόφιμα. Για να περιοριστεί το πρόβλημα, οι νομοθετικές αρχές έχουν θεσπίσει ανώτατα επιτρεπτά όρια για τα περισσότερα αντιβιοτικά. Τα σουλφοναμίδια (sulfonamides, SAs) είναι η πρώτη κατηγορία εμπορικά διαθέσιμων αντιβιοτικών και παραμένουν από τις πιο δημοφιλείς. Αυτός είναι και ο λόγος για τον οποίο αναπτύσσονται πολλές αναλυτικές μέθοδοι για τον προσδιορισμό τους. Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής, αναπτύχθηκαν τέσσερα (νανο)υλικά και χρησιμοποιήθηκαν σε τεχνικές προκατεργασίας δείγματος, προκειμένου να γίνει εκχύλιση των SAs από περιβαλλοντικά δείγματα και δείγματα τροφίμων και κατά συνέπεια, προέκυψαν τέσσερις νέες αναλυτικές μέθοδοι. Πραγματοποιήθηκε διαχωρισμός των SAs χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία (HPLC) και η ταυτοποίηση/ποσοτικοποίηση των ενώσεων επετεύχθη με έναν ανιχνευτή συστοιχίας διόδων (diode array detector). Τα σουλφοναμίδια τα οποία εξετάστηκαν είναι τα εξής: σουλφακεταμίδιο, σουλφαθειαζόλη, σουλφαδιαζίνη, σουλφαπυριδίνη, σουλφαμεραζίνη, σουλφαμεθαζίνη, σουλφαμεθοξυπυριδαζίνη, σουλφαχλωροπυριδαζίνη, σουλφαμεθοξαζολη, σουλφαδιμεθοξινη, σουλφισοξαζολη, και σουλφακινοξαλινη. Για την ανάπτυξη της πρώτης μεθόδου, σπόγγοι μελαμίνης τροποποιήθηκαν με γραφένιο (graphene-modified melamine sponges, GMeS) και χρησιμοποιήθηκαν ως προσροφητικό υλικό. Οι τροποποιημένοι σπόγγοι μελαμίνης παρασκευάστηκαν με μια απλή διαδικασία που ολοκληρώθηκε σε ένα στάδιο και η οποία όχι μόνο είναι σύμφωνη με τις αρχές τις πράσινης Χημείας, αλλά πλεονεκτεί σε σχέση με προηγούμενες μεθόδους που αναφέρονται στη βιβλιογραφία σε σχέση με τη σύνθεση τροποποιημένων σπόγγων μελαμίνης με γραφένιο. Μελετήθηκε η καταλληλότητα των GMeS για την εκχύλιση των SAs και αναπτύχθηκε μια αναλυτική μέθοδος για τον προσδιορισμό τους σε δείγματα γάλακτος, αυγών και νερού λίμνης. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε επικυρώθηκε σύμφωνα με την οδηγία SANCO/12571/2013 και αποδείχθηκε ότι είναι ακριβής και επαναλήψιμη, ενώ τα όρια ποσοτικοποίησης είναι χαμηλά (0,31-0,91 μg/kg, 0,96-1,32 μg/kg και 0,10-0,29 μg/L για τα δείγματα γάλακτος, αυγών και νερού λίμνης, αντίστοιχα). Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκε σημαντική επίδραση από τα μελετούμενα υποστρώματα, καθώς η τεχνική μικροεκχύλισης που αναπτύχθηκε λειτουργεί και ως στάδιο καθαρισμού. Το χαμηλό κόστος, η φιλική προς το περιβάλλον σύνθεση και οι υψηλές ανακτήσεις είναι μερικά ακόμα από τα πλεονεκτήματα της μεθόδου που αναπτύχθηκε. Για την ανάπτυξη της δεύτερης μεθόδου τροποποιήθηκαν σπόγγοι μελαμίνης με μεταλλικά φύλλα χαλκού (CuMeS). Οι CuMeS παρασκευάστηκαν με μια γρήγορη διαδικασία που ολοκληρώθηκε σε ένα στάδιο (χωρίς τη δημιουργία οξειδίων του χαλκού) και χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη μιας ευαίσθητης και εκλεκτικής μεθόδου προκατεργασίας για την εκχύλιση SAs από δείγματα γάλακτος και νερού λίμνης. Η επιφάνεια των παρασκευασμένων CuMeS, μετά τη ξήρανσή τους καθίσταται υδρόφοβη, γεγονός που επιτρέπει την ανάπτυξη υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Επιπλέον, είναι η πρώτη φορά που αξιοποιείται η μεγάλη συγγένεια του χαλκού για τα SAs στην αναλυτική χημεία. Λόγω της μεγάλης εκλεκτικότητας, η μέθοδος που αναπτύχθηκε αποτελεί τόσο ένα βήμα εκχύλισης, όσο και ένα βήμα καθαρισμού για τον ποσοτικό προσδιορισμό των SAs. Η αναλυτική μέθοδος έχει ευρεία γραμμική περιοχή (η οποία περιλαμβάνει συγκεντρώσεις μεγαλύτερες και μικρότερες από το ανώτατο επιτρεπτό όριο που έχει θεσπιστεί για τα SAs), χαμηλά όρια ποσοτικοποίησης (0,025–0,057 μg/L για δείγματα νερού λίμνης και 0,23–1,05 μg/L για δείγματα γάλακτος), ιδιαίτερα ικανοποιητικές ανακτήσεις και καλή αναπαραγωγιμότητα. Η μέθοδος επικυρώθηκε σύμφωνα με την απόφαση Commission Decision 657/2002/EC. Η τρίτη μέθοδος αποτελεί μια βελτιωμένη παραλλαγή της μικροεκχύλισης διασποράς υγρού-υγρού με χρήση μαγνητικών ιοντικών υγρών. Η διαδικασία συνδυάζει ένα αδιάλυτο στο νερό υποστηρικτικό υλικό και το ιοντικό υγρό [P66614+][Dy(III)(hfacac)4-] και μέσω της μεταβολής pH στο ίδιο δείγμα επιτρέπει την ταυτόχρονη μικροεκχύλιση των SAs και των τριαζινών. Το στερεό υπόστρωμα αναμιγνύεται με το μαγνητικό ιοντικό υγρό προκειμένου να ξεπεραστούν οι δυσκολίες που αντιμετωπίζονται κατά τη ζύγιση του μαγνητικού ιοντικού υγρού και για να καταστεί πιο ομοιόμορφη η διασπορά του, καθιστώντας την προτεινόμενη μέθοδο πιο επαναλήψιμη. Η μεταβολή του pH του δείγματος κατά το στάδιο της εκχύλισης επιτρέπει την εκχύλιση των SAs και των τριαζινών από το ίδιο δείγμα μέσα σε 15 λεπτά. Η νέα αυτή αναλυτική μέθοδος είναι ευαίσθητη (όρια ποσοτικοποίησης: 0,034-0,091 μg/L) και επαναλήψιμη (σχετική τυπική απόκλιση: 5,2-8,1%), ενώ επιτυγχάνει καλές ανακτήσεις (89-101%) για δείγματα νερού λίμνης και βιολογικού καθαρισμού. Τέλος, αναπτύχθηκε μια αναλυτική μέθοδος βασισμένη σε φερρίτες ψευδαργύρου σε μια διαδικασία μικροεκχύλισης διασποράς μαγνητικής στερεάς φάσης, υποβοηθούμενη από υπερήχους. Παρόλο που είναι γνωστό ότι ο ψευδάργυρος εμφανίζει μεγάλη συγγένεια για τα SAs, δεν υπάρχουν μέθοδοι προκατεργασίας δείγματος που να βασίζονται σε αυτήν την ιδιότητα. Η σύνθεση των φερριτών του ψευδαργύρου γίνεται απευθείας και το προκύπτον υλικό εμφανίζει αξιόλογες μαγνητικές ιδιότητες, οι οποίες επιτρέπουν τη συλλογή τους μετά την εκχύλιση. Οι φερρίτες ψευδαργύρου μπορούν να εκχυλίσουν αποδοτικά και εκλεκτικά τα SAs από δείγματα νερού λίμνης και αυγών. Η νέα διαδικασία επιτυγχάνει χαμηλά όρια ποσοτικοποίησης (0,06 μέχρι 0,11 μg/L), αποδεκτές ανακτήσεις (88-101%), ικανοποιητικούς συντελεστές προσυγκέντρωσης (111-141), ενώ επηρεάζεται ελάχιστα από το υπόστρωμα (από -8% έως 8%). Επιπλέον, η μέθοδος έχει μεγάλη γραμμική περιοχή (μέχρι τα 250 μg/L) γεγονός που επιτρέπει τον προσδιορισμό των SAs σε μεγαλύτερες και μικρότερες συγκεντρώσεις από το ανώτατο επιτρεπτό όριο. Λόγω των προαναφερθέντων πλεονεκτημάτων, της απλότητας, ευκολίας σύνθεσης του προσροφητικού και την αποδοτικότητα της όλης διαδικασίας, η μέθοδος που αναπτύχθηκε μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε αναλύσεις ρουτίνας για τα σουλφοναμίδια.