Ανοσογενετική μελέτη των περιστατικών οικογενούς μορφής σκλήρυνσης κατά πλάκας στον ελληνικό πληθυσμό, και συσχέτιση με κλινικά και παρακλινικά δεδομένα

Abstract

BACKGROUND - AIMS: Multiple Sclerosis (MS), the main Demyelinating Disease of the Central Nervous System (CNS), is considered to have a very complex pathophysiology, which gathers scientific attention during the last fifty years. The disease comes as the result of the interaction of multiple endogenous and exogenous predisposing factors, among which the immunogenetic background holds a leading position. It has been repeatedly observed that the risk of developing MS is correlated with certain class II allelic polymorphisms within the Major Histocompatibility Complex (MHC), mainly the carriage of HLA-DRB1*15:01. Nevertheless, it seems that numerous different Human-Leucocyte-Antigens (HLA) Class I and II, as well as non-HLA genetic loci, and the epistatic mechanisms among them, are also implicated in the overall MS genetic burden. Another fact, that underlines the great significance of the genome in MS, is made obvious by the considerable percentage of familial cases (familial Multiple Sclerosis –fMS), that is estimated around 12.6% of all incidents in the international literature. Hence, the relative lack of scientific information regarding differences between fMS and sporadic Multiple Sclerosis (sMS), concerning their immunogenetic and non-immunogenetic (demographic, clinical, labolatorial and imaging) characteristics, comes as a big surprise. Principal goal of this thesis was the investigation and description of possible immunogenetic (regarding DRB1 locus) and non-immunogenetic differences between fMS and sMS, performed for the first time in a sample of MS patients of Greek origin, from all over Greece. Observation of possible correlations between certain DRB1 polymorphisms and specific demographic, clinical, imaging and laboratorial traits of MS in general, was an additional secondary goal. MATERIALS - METHODS: 128 fMS and 364 sMS patients of Greek origin, diagnosed with Clinically Definite MS (CDMS) according to 2017 revised McDonald criteria, were included in this study and gave information regarding demographic (age, gender, age at disease onset, other autoimmune disorders in themselves and their 1st degree relatives), clinical [disease type, first symptoms, number of relapses, relapse rate, time of conversion from Clinically Isolated Syndrome (CIS) to CDMS, treatment, degree of disability and disability progression rate], laboratorial [presence of Oligoclonal Bands in the Cerebrospinal Fluid (CSF)], and imaging (lesion distribution in brain and spinal cord, tumefactive lesions) parameters. Among them, 57 non-related fMS and 141 sMS patients gave consent for DRB1 immunogenetic typing, which was performed by a low-resolution SSO technique. Allelic frequencies in the above samples were also compared with the corresponding frequencies of a sample of 246 Greek origin healthy controls, which were described in a previous study, after obtaining the appropriate permissions. Statistical analyses were done with the use of SPSS v.21.0. The level of statistical significance was set at 0.05, while p value was further corrected by the Benjamini–Yekutieli method, in the case of multiple allelic frequency correlations. Hardy-Weinberg proportions (HWP) for DRB1 haplotypes were confirmed by a PyPoP software, while Ewens-Watterson (EW) homozygosity tests for neutrality were also performed.RESULTS: fMS was found in a frequency of 13.1% among the initially screened sample of candidate participants. 59% of fMS cases were linked to their affected relatives maternally. fMS started less frequently with double vision (3.1% vs 13.7%, p=0.003), and was linked less frequently with brainstem lesions (49.6% vs 64.8%, p=0.006), and subtentorial lesions in general (64.5% vs 74.8%, p=0.048), in comparison to sMS. 1st degree relatives of fMS patients were more frequently diagnosed with Hashimoto’s thyroiditis, with reference to those of sMS patients (9.8% vs 3.3%, p=0.033). fMS displayed internal heterogeneity, with anticipation effects in age at disease onset, between older and younger generation (39.7 vs 24.5 years, p=0.001), and earlier progression from CIS to CDMS in younger generation patients (30.1 vs 83.3 months, p=0.037). Earlier progression from CIS to CDMS was also noted for the fMS subgroup with 2nd or 3rd degree relatives affected (fMS 2nd/3rd) in comparison to the fMS 1st subgroup (1st degree relatives affected, 27.9 vs 43.6 months, p=0.047). HLA-DRB1*15 allelic frequency was significantly higher with reference to normal controls, for both the fMS (31.6% vs 16.7%, p=0.002), and the sMS (31.2% vs 16.7%, p<0.001) study groups, although the statistical power of this finding was degraded in the fMS 1st subgroup (24.1% vs 16.7%, p=0.205), but not in the fMS 2nd/3rd subgroup (39.3% vs 16.7%, p=0.012). On the contrary, HLA-DRB1*11 allelic frequency was found significantly lower, with reference to normal controls, only in the case of the sMS group (31.9% vs 52%, p<0.001), while the fMS patients were carrying the allele in a greater percentage (49.1%), mainly due to the fMS 1st subgroup (58.6%). No significant deviations from the HWPs were detected, while the EW tests for neutrality did not show any preference for homozygosity over heterozygosity, for all the groups and subgroups of patients in the study. In regards to the study’s secondary goal, we found positive correlation of DRB1*03 carriage with younger age at disease onset (26.4 vs 30.3 years, p=0.04), positive correlation of DRB1*04 carriage with presence of 1st degree relatives diagnosed with other autoimmune disorders (61.1% vs 26%, p=0.01), negative correlation of DRB1*13 carriage with optic neuritis as first MS symptom (3.6% vs 24%, p=0.011), negative correlation of DRB1*14 carriage with presence of thoracic demyelinating lesions (28.6% vs 73.3%, p=0.024), and negative correlation of DRB1*16 carriage with presence of thoracic demyelinating lesions (53.6% vs 76.9%, p=0.029), in the total sample of MS patients. CONCLUSIONS: fMS was found to represent a significant minority in our sample of MS patients of Greek origin (1 out of 8 approximately), and was inherited more frequently through a maternal line. Regarding its phenotype, it was shown to be relatively more isolated in the supratentorial areas in comparison to sMS, as well as more commonly related with familial predisposition for Hashimoto’s thyroiditis. With reference to the immunophenotype, the influence of the DRB1 locus was somewhat degraded in fMS, compared to sMS, with the exception of the DRB1*15 risk allele. HLA genotype – clinical phenotype correlations, which represented the secondary goal of this study, did not reach the level of statistical significance, independently for the fMS group, fact which is futher supportive of the true existence of the above mentioned degradation. Making a first attempt of interpreting this observation, we believe that a predisposing DRB1 immunogenetic background is not sufficient on its own to lead to MS development by multiple close relatives within the same family. Several epistatic mechanisms are also required (probably within the MHC), as well as the concomitant carriage of several other HLA and non-HLA predisposing polymorphisms, additionally to the possible influence of certain superimposed, deleterious, environmental factors.

ΥΠΟΒΑΘΡΟ - ΣΚΟΠΟΣ: Η παθοφυσιολογία της Σκλήρυνσης κατά Πλάκας (ΣκΠ) ή Πολλαπλής Σκλήρυνσης με τη νεώτερη ορολογία, θεωρείται εξαιρετικά πολύπλοκη, γι’ αυτό και συγκεντρώνει πάνω της τα φώτα του επιστημονικού ενδιαφέροντος τα τελευταία πενήντα χρόνια. Η πάθηση προκύπτει ως αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης πολλαπλών ετερογενών εξωγενών και ενδογενών προδιαθεσικών παραγόντων, μεταξύ των οποίων το ανοσογενετικό υπόβαθρο επιβεβαιωμένα διαδραματίζει πρωταρχικό ρόλο. Έχει επανειλημμένα διαπιστωθεί ότι ο κίνδυνος εκδήλωσης ΣκΠ σχετίζεται σαφώς με συγκεκριμένους πολυμορφισμούς αλληλίων Τάξης ΙΙ του Μείζονος Συμπλέγματος Ιστοσυμβατότητας (Major Histocompatibility Complex – MHC), και ειδικότερα με τη φορεία του HLA-DRB1*15:01. Παρόλα αυτά, πληθώρα έτερων HLA Ταξης Ι και Τάξης ΙΙ, αλλά και non-HLA γενετικών τόπων, όπως και οι μεταξύ τους επιστατικοί μηχανισμοί, φαίνεται να συμβάλλουν επίσης στο καθορισμό του γενετικού φορτίου της νόσου. Ένα ακόμη γεγονός, που υπογραμμίζει τη μεγάλη σημασία του γονιδιώματος στην περίπτωση της ΣκΠ, έχει να κάνει με τη μεγάλη συχνότητα των οικογενών περιπτώσεων (familial Multiple Sclerosis –fMS) μεταξύ του συνόλου των ασθενών, που σύμφωνα με διεθνείς μελέτες αγγίζει το ποσοστό του 12.6%. Προκαλεί συνεπώς έκπληξη η σχετική βιβλιογραφική ένδεια πληροφοριών σχετικά με τις ιδιαιτερότητες της fMS σε σύγκριση με την κοινή – σποραδική μορφή της νόσου (sporadic Multiple Sclerosis –sMS), τόσο σε ότι αφορά τα ανοσογενετικά, όσα και τα μη ανοσογενετικά (δημογραφικά, κλινικά, παρακλινικά) χαρακτηριστικά τους. Πρωτογενής στόχος της παρούσας διατριβής λοιπόν αποτελούσε η διερεύνηση και περιγραφή των πιθανών ανοσογενετικών (αναφορικά με τον DRB1 τόπο) και μη ανοσογενετικών διαφορών μεταξύ fMS και sMS, για πρώτη φορά σε δείγμα ασθενών Ελληνικής καταγωγής. Δευτερογενής στόχος ήταν η ανεύρεση πιθανών συσχετίσεων συγκεκριμένων HLA-DRB1 πολυμορφισμών με επιμέρους δημογραφικά, κλινικά ή/και παρακλινικά χαρακτηριστικά της ΣκΠ γενικότερα. ΥΛΙΚΟ - ΜΕΘΟΔΟΣ: 128 fMS και 364 sMS ασθενείς Ελληνικής καταγωγής με επιβεβαιωμένη ΣκΠ, σύμφωνα με τα αναθεωρημένα κριτήρια McDonald 2017, έλαβαν μέρος στη μελέτη, και παρείχαν πληροφορίες σχετικά με παραμέτρους δημογραφικές (ηλικία, φύλο, ηλικία έναρξης νόσου, έτερα αυτοάνοσα νοσήματα στους ίδιους και σε 1ου βαθμού συγγενείς τους), κλινικές [τύπος νόσου, πρώτο σύμπτωμα, αριθμός / ρυθμός υποτροπών, χρόνος μετάπτωσης από το κλινικά μεμονωμένο σύνδρομο (CIS) στη βέβαια νόσο (CDMS), φαρμακευτική αγωγή, βαθμός αναπήριας και ρυθμός εξέλιξης αναπηρίας] και παρακλινικές [παρουσία ολιγοκλωνικών ζωνών στο Εγκεφαλονωτιαίο Υγρό (ΕΝΥ), κατανομή βλαβών σε MRI εγκεφάλου και νωτιαίου μυελού, παρουσία ογκόμορφων απομυελινωτικών βλαβών]. Εξ αυτών, 57 μη σχετιζόμενοι fMS και 141 sMS ασθενείς έδωσαν συγκατάθεση για DRB1 ανοσογενετική τυποποίηση, που πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια low-resolution SSO τεχνικής. Οι ευρεθείσες συχνότητες αλληλίων στα υπόψη δείγματα συγκρίθηκαν, μεταξύ άλλων, και με τις αντίστοιχες συχνότητες σε δείγμα 246 Ελλήνων υγιών μαρτύρων προηγούμενης μελέτης, κατόπιν σχετικής συγκατάθεσης. Η στατιστική επεξεργασία του υλικού έγινε με τη βοήθεια του στατιστικού πακέτου SPSS v.21.0. Το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίσθηκε στο 0.05, ενώ η τιμή του p για τις πολλαπλές συγκρίσεις συχνοτήτων αλληλίων διορθώθηκε περαιτέρω με τη βοήθεια της μεθόδου Benjamini–Yekutieli. Οι ισορροπίες Hardy-Weinberg για τους DRB1 απλότυπους επιβεβαιώθηκαν με τη βοήθεια λογισμικού PyPoP, ενώ ο έλεγχος ουδετερότητας ομοζυγωτίας / ετεροζυγωτίας πραγματοποιήθηκε με tests Ewens-Watterson. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Η συχνότητα των fMS περιστατικών μεταξύ του αρχικού δείγματος υποψηφίων συμμετεχόντων ασθενών υπολογίσθηκε στο 13.1%. O γονεϊκός τρόπος μεταβίβασης της νόσου στο fMS δείγμα βρέθηκε μητρικός στο 59% των περιπτώσεων. H fMS εισέβαλε σημαντικά σπανιότερα με διπλωπία σε σύγκριση με την sMS (3.1% vs 13.7%, p=0.003), ενώ ταυτόχρονα εμφάνιζε λιγότερο συχνά απομυελινωτικές βλάβες σε στέλεχος (49.6% vs 64.8%, p=0.006), και σε υποσκηνίδιες εγκεφαλικές περιοχές εν γένει (64.5% vs 74.8%, p=0.048). Οι πρώτου βαθμού συγγενείς των fMS ασθενών έπασχαν σημαντικά συχνότερα από θυρεοειδίτιδα Hashimoto, σε σύγκριση με εκείνους των sMS ασθενών (9.8% vs 3.3%, p=0.033). Η fMS βρέθηκε να παρουσιάζει εσωτερική ανομοιογένεια, με επίσπευση στην ηλικία έναρξης μεταξύ παλαιότερης και νεώτερης γενιάς (39.7 vs 24.5 έτη, p=0.001), και με ταχύτερη μετάβαση από το CIS στην CDMS στη δεύτερη περίπτωση (30.1 vs 83.3 μήνες, p=0.037). Ταχύτερη μετάβαση από το CIS στην CDMS διαπιστώθηκε και για τους fMS ασθενείς με συγγενείς πάσχοντες 2ου/3ου βαθμού (fMS 2nd/3rd), σε σχέση με τους fMS 1st, που είχαν συγγενή 1ου βαθμού πάσχοντα (27.9 vs 43.6 μήνες, p=0.047). Η συχνότητα του HLA-DRB1*15 ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες, τόσο στην ομάδα των fMS (31.6% vs 16.7%, p=0.002), όσο και sτην ομάδα των sMS ασθενών (31.2% vs 16.7%, p<0.001), αποτέλεσμα που φάνηκε να αποδυναμώνεται ωστόσο στην υποομάδα των fMS 1st (24.1% vs 16.7%, p=0.205), αναλογικά με την fMS 2nd/3rd (39.3% vs 16.7%, p=0.012). Αντίθετα, η συχνότητα του HLA-DRB1*11 βρέθηκε σημαντικά μικρότερη ως προς τους υγιείς μάρτυρες, μόνο στην περίπτωση του sMS δείγματος (31.9% vs 52%, p<0.001), ενώ οι fMS ασθενείς παρουσίαζαν σε μεγαλύτερη συχνότητα το αλλήλιο (49.1%), κυρίως λόγω της υποομάδας fMS 1st (58.6%). Δεν εντοπίσθηκε στατιστικά σημαντική απόκλιση από την ισορροπία Hardy-Weinberg, αλλά ούτε και στατιστικά σημαντική εύνοια της ομοζυγωτίας στο συνολικό δείγμα και στις επιμέρους ομάδες της μελέτης. Αναφορικά με το δευτερογενή στόχο της μελέτης διαπιστώθηκαν, στο συνολικό δείγμα ασθενών, θετική συσχέτιση φορείας DRB1*03 με πρωιμότερη ηλικία έναρξης νόσου (26.4 vs 30.3 έτη, p=0.04), θετική συσχέτιση φορείας DRB1*04 με εύρεση 1ου βαθμού συγγενών πασχόντων από άλλες αυτοάνοσες παθήσεις (61.1% vs 26%, p=0.01), αρνητική συσχέτιση φορείας DRB1*13 με οπτική νευρίτιδα ως πρώτο σύμπτωμα νόσου (3.6% vs 24%, p=0.011), αρνητική συσχέτιση φορείας DRB1*14 με απομυελινωτικές βλάβες θωρακικού μυελού (28.6% vs 73.3%, p=0.024), όπως και αρνητική συσχέτιση φορείας DRB1*16 με απομυελινωτικές βλάβες θωρακικού μυελού (53.6% vs 76.9%, p=0.029). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Η fMS αποτελούσε μία σημαντική μειοψηφία του δείγματος ασθενών ΣκΠ Ελληνικής καταγωγής (1 στους 8 περίπου), μεταβιβαζόμενη συνήθως με μητρικό τρόπο. Από πλευράς φαινοτύπου, φάνηκε να είναι πιο περιορισμένη υπερσκηνιδιακά, σε σύγκριση με την sMS, και να συνδυάζεται συχνότερα με οικογενειακή προδιάθεση θυρεοειδίτιδας Hashimoto. Από πλευράς γονοτύπου, η επίδραση του DRB1 τόπου βρέθηκε σχετικά υποβαθμισμένη στην fMS, αναλογικά με την sMS, με την εξαίρεση του ρόλου που διαδραματίζει το αλλήλιο κινδύνου DRB1*15. Οι συσχετίσεις HLA γονοτύπου – κλινικού φαινοτύπου, που ήταν ο δευτερογενής στόχος της μελέτης, δεν έφτασαν σε καμία περίπτωση το επίπεδο της στατιστικής σημαντικότητας, ανεξάρτητα για την ομάδα fMS, γεγονός που υποστηρίζει περαιτέρω την πραγματική ύπαρξη της εν λόγω υποβάθμισης. Σε μία πρώτη απόπειρα ερμηνείας αυτής της διαπίστωσης, πιστεύουμε ότι προκειμένου να εμφανιστούν πολλαπλές περιπτώσεις προσβεβλημένων στενών συγγενών από ΣκΠ σε μια οικογένεια, δεν αρκεί από μόνος του ο DRB1 τόπος, ως επιβαρυντικό ανοσογενετικό υπόβαθρο. Χρειάζεται συνάμα να επιδράσουν και κάποιοι επιστατικοί μηχανισμοί (πιθανόν εντός του MHC) ή/και να συνυπάρξουν άλλοι HLA και non-HLA επιβαρυντικοί πολυμορφισμοί, ή τέλος και κάποιοι ιδιαίτεροι επιβλαβείς περιβαλλοντικοί παράγοντες.