Μελέτη της κυτταρικής σηματοδότησης του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών (GR) στο σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2

Abstract

Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) is a chronic disease characterized by disturbed carbohydrate (hyperglycemia), fat and protein metabolism as well as by decreased secretion and/or effect of insulin, resulting in an absolute or relative insulin-deficiency. T2DM is one of the leading causes of increased morbidity and early mortality worldwide and has seen a dramatic increase in adults, children and adolescents. It is therefore imperative to broaden the scientific knowledge on the mechanisms that are disrupted in T2DM and find new therapeutic strategies. Many studies support the significant impact of stress in T2DM. Moreover, decreased negative feedback and hyperactivation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis characterizes T2DM. The glucocorticoid receptor (GR) is a key mediator of HPA axis negative feedback, however its role in linking hypercortisolemia and T2DM-associated hyperglycemia, hyperlipidemia and inflammation is not known. Moreover, it is completely unknown whether the potential abnormalities in the GR-signaling pathway are related to the metabolic disturbances and inflammation that characterize T2DM. Main purpose of this thesis is to investigate the possible role of GR as the “biological link” between hypercortisolemia and the metabolic disturbances as well as the inflammation observed in T2DM. Consequently, we investigated the hypothesis that an impaired GR function (GC resistance) may be associated with HPA axis hyperactivity and increased cortisol levels which in turn lead to abnormalities in peripheral metabolic tissues (such as hyperglycemia, hyperlipidemia) and increased inflammation in immune cells in T2DM patients. Due to limited access in brain GRs, we carried out our investigation in PBMCs since data support that GRs are similarly regulated in the brain and immune system and GR changes in brain parallel those in immune cells. Moreover, PBMCs are considered today as a model system to study the pathophysiology of diabetes and its complications. In 31 T2DM patients and 24 healthy controls a) we assessed various GR signaling parameters in PBMCs, b) we determined salivary cortisol parameters (as a measure of HPA axis activity) and c) we investigated the possible associations between GR- and cortisol parameters as well as with measures of glycaemia, lipidemia, inflammation, and energy metabolism. Regarding the parameters of the GR-signaling pathway we determined: the total GR protein levels, the phosphorylated bioactive GR protein levels (pGR-S211), the gene expression ratio GRα/GRβ and the glucocorticoid (GC) sensitivity. GC sensitivity was assessed by determining the gene expression levels of dexamethasone (DEX)-induced GILZ (glucocorticoid-induced leucine zipper) and FKBP5 (FK506 binding-protein) as well as basal protein levels of interleukin-1β (IL-1). Regarding the diurnal salivary cortisol curve, it was constructed after determining cortisol levels in four saliva samples and we calculated various cortisol parameters such as the cortisol awaking response (CAR), the reactivity slope (slopeT0-T40), the overall slope (slopeT0-T23), the diurnal cortisol secretion (total area under the curve, AUCtotal) and the cortisol secretion during awaking (area under the curve with respect to increase, AUCi). Furthermore, we measured biochemical markers [fasting glucose, insulin, triglycerides, glycosylated hemoglobin (HbA1), HDL- and LDL-cholesterol], inflammatory markers (intracellular IL-1β levels), energy metabolism markers [AMP-activated protein kinase phosphorylated at Thr172 (pAMPKα-Thr172) protein levels], plasma antiponectin levels, pyruvate dehydrogenase kinase 4 (PDK4) gene expression levels and apoptosis markers. Finally, both GR signaling parameters and salivary cortisol parameters were correlated with indices of glycemia, lipidemia, inflammation, and energy metabolism. Our results show that patients with T2DM have elevated body mass index (BMI), abdominal fat, fasting glucose, insulin, triglycerides and HbA1 levels as well as decreased LDL- and HDL-cholesterol levels and PDK4 gene expression compared to healthy population. These data are consistent with the presence of metabolic disturbances in T2DM. Diabetic patients have elevated total GR protein and GRβ gene expression levels as well as decreased bioactive pGR-S211 protein levels compared to healthy controls. GC resistance in T2DM patients is confirmed by reduced mRNA expression levels of GILZ and FKBP5 as well as by increased basal IL-1β protein levels. Moreover, T2DM patients have decreased basal GILZ and FKBP5 mRNA levels and flattened DEX-induced GILZ and FKBP5 response curves. These results show the existence of GC resistance in patients with T2DM. All of the above findings support an impaired GR-signaling in immune cells of T2DM patients reflecting possibly, an impaired GR-signaling in HPA axis tissues. Decreased salivary cortisol secretion profile is evidenced by flattened diurnal salivary cortisol curves, reduced CAR, slopeT0-T30 and AUCi values as well as by increased AUCtotal scores compared to healthy controls. These data support the reduced function of the HPA axis. Moreover, diabetic patients have elevated IL-1β and decreased pAMPKα-Thr172 protein levels, findidings which are consistent with the presence of increased inflammation and reduced energy metabolism in T2DM. Finally T2DM patients also show lower rate of apoptosis in PBMCs. An important finding of the present study is the statistically significant correlations of GR signaling parameters with inflammation and metabolism parameters. These correlations suggest that the GR dysfunction in PBMCs (which possibly reflects the GR dysfunction in HPA axis in brain) may lead to hyperglycemia, hyperlipidemia and increased inflammation in T2DM. The statistically significant correlations between the diurnal saliva cortisol parameters and measures of metabolism and inflammation support that the HPA axis hyperactivity leads to metabolic disturbances and increased inflammation in T2DM. All of the above correlations seem to confirm the original hypothesis of the study that in T2DM the presence of an impaired GR function and GC resistance in immune cells, are possibly linked to HPA axis GC resistance, HPA axis hyperactivity and hypercortisolemia, leads in turn, to abnormal GC-function in metabolic tissues (hyperglycemia, hyperlipidemia). On the other hand, GC resistance in PBMCs may result in increased inflammation in immune cells. In conclusion, our study supports that the GR dysfunction is the key biological link between hypercortisolism and metabolic disorders and inflammation in T2DM. Regarding the relationship between diet and T2DM, the guidelines for clinical practice underlie the important role of nutrition in T2DM prevention and treatment. Consequently, patients are often encouraged to use alternative sweeteners, such as steviol glycosides. Although the consumption of steviol glycosides is considered safe, recent data suggest that stevioside (a steviol glycoside) exhibits dexamethasone-like action in macrophages acting through glucocorticoid response elements (GREs). These possible effects of steviol glycosides would be detrimental for metabolism. Hence, another important aim of the present study was to evaluate the impact of steviol, steviol glycosides, and a Greek-derived stevia extract on a number of key steps of GR signaling cascade in PBMCs from 4 healthy individuals. In particular, we measured the mRNA levels of the genes GILZ and FKBP5, the total GR protein levels, and the subcellular compartmentalization of GR. We also assessed the effect of the aforementioned natural sweeteners on GILZ and FKBP5 expression levels in whole blood from healthy volunteers following an oral consumption of a mixture of steviol glycosides. Our results revealed that none of the tested compounds (steviol, steviol glycosides, and Greek-derived stevia extract) altered the expression of the primary GR-target genes GILZ and FKPB5, GR protein levels or GR subcellular localization in PBMCs. These findings support that steviol, steviol glycosides, and a Greek-derived stevia extract do not exert GR-mediated effects in PBMCs and therefore it is unlikely to adversely affect metabolism.

Ο Σακχαρώδης Διαβήτης τύπου 2 (ΣΔτ2) είναι μια χρόνια νόσος που χαρακτηρίζεται από διαταραχή του μεταβολισμού των υδατανθράκων (υπεργλυκαιμία), των λιπών και των πρωτεϊνών και οφείλεται σε μειωμένη έκκριση ή/και σε δράση της ινσουλίνης, με αποτέλεσμα την απόλυτη ή σχετική έλλειψη αυτής. Ένας σημαντικός παράγοντας στην πρόληψη και στην αντιμετώπιση του ΣΔτ2 είναι η σωστή και ελεγχόμενη διατροφή που συχνά περιλαμβάνει γλυκαντικές ουσίες (πχ γλυκοζίτες στεβιόλης). Ο ΣΔτ2 αποτελεί παγκοσμίως μια από τις κυριότερες αιτίες αυξημένης νοσηρότητας και πρόωρης θνητότητας και παρατηρείται θεαματική αύξηση του στους ενήλικες καθώς και στα παιδιά και στους εφήβους. Για όλους τους παραπάνω λόγους είναι επιτακτικό να διευρυνθεί η επιστημονική γνώση πάνω στους μηχανισμούς που είναι διαταραγμένοι στο ΣΔτ2, να ανοιχτούν νέοι ορίζοντες για τη εύρεση θεραπευτικών στρατηγικών σε νέα μοριακά μονοπάτια και να διερευνηθεί η πιθανή δράση των γλυκαντικών ουσιών στα μονοπάτια αυτά. Οι μέχρι τώρα μελέτες υποστηρίζουν τη σημαντική επίπτωση του στρες και την αυξημένη δραστηριότητα του άξονα υποθαλάμου–υπόφυσης-επινεφριδίων (ΗΡΑ) στο ΣΔτ2 με συνέπεια την υπερκορτιζολαιμία. Είναι γνωστό ότι οι δράσεις των γλυκοκορτικοειδών (GC) στη ρύθμιση του άξονα HPA διαμεσολαβούνται από τον υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών (GR). Ωστόσο το σηματοδοτικό μονοπάτι του υποδοχέα δεν έχει μελετηθεί σε ασθενείς με ΣΔτ2. Επιπλέον, είναι εντελώς άγνωστο αν οι πιθανές διαταραχές στο σηματοδοτικό μονοπάτι του GR σχετίζονται με τις διαταραχές του μεταβολισμού και τη φλεγμονή που χαρακτηρίζει το ΣΔτ2. Πρωταρχικός λοιπόν σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση του πιθανού ρόλου του GR ως ο «βιολογικός σύνδεσμος» μεταξύ της υπερκορτιζολαιμίας και των μεταβολικών διαταραχών και της φλεγμονής που παρατηρούνται στο ΣΔτ2. Εξετάστηκε λοιπόν η υπόθεση που υποστηρίζει ότι «στους ασθενείς με ΣΔτ2 υπάρχει μειωμένη λειτουργία του GR στον άξονα ΗΡΑ η οποία μπορεί να οδηγήσει σε υπερδραστηριότητά του καθώς και σε υπερκορτιζολαιμία». Οι διαταραχές αυτές του υποδοχέα GR πιθανά να ευθύνονται για την υπερκορτιζολαιμία και τις δυσμενείς συνέπειές της στους περιφερικούς μεταβολικούς ιστούς (υπεργλυκαιμία, υπερλιπιδαιμία) και την αυξημένη φλεγμονή στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος που παρατηρούνται στο ΣΔτ2. Λόγω της δυσκολίας που υπάρχει στο να απομονωθούν και να μελετηθούν τα κύτταρα του εγκεφάλου σε άτομα εν ζωή, διεξήγαμε την έρευνά μας σε περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα (PBMC) δεδομένου ότι οι υποδοχείς GR ρυθμίζονται κατά παρόμοιο τρόπο με αυτόν των κυττάρων του εγκεφάλου. Επιπλέον, τα κύτταρα PBMC θεωρούνται ένα πρότυπο σύστημα για τη μελέτη της παθοφυσιολογίας του ΣΔτ2 και των επιπλοκών του. Σε κύτταρα PBMC από 31 ασθενείς με ΣΔτ2 και από 24 υγιή άτομα αξιολογήσαμε α) διάφορες σημαντικές παραμέτρους του σηματοδοτικού μονοπατιού του GR, β) παραμέτρους της καμπύλης ημερήσιας έκκρισης κορτιζόλης σιέλου (ως μέτρο αξιολόγησης της δραστηριότητας του άξονα ΗΡΑ) καθώς και γ) τις πιθανές συσχέτισες των παραπάνω παραμέτρων με δείκτες γλυκαιμίας, λιπιδαιμίας, φλεγμονής και ενεργειακού μεταβολισμού. Αναλυτικότερα, όσον αφορά τις παραμέτρους του σηματοδοτικού μονοπατιού του GR προσδιορίσαμε: τα ολικά επίπεδα της πρωτεΐνης του υποδοχέα GR, τα πρωτεϊνικά επίπεδα της φωσφορυλιωμένης μορφής του υποδοχέα (pGR-S211), το λόγο έκφρασης των γονιδίων GRα/GRβ και την ευαισθησία στα γλυκοκορτικοειδή. Η ευαισθησία στα γλυκοκορτικοειδή αξιολογήθηκε μέσω της βασικής και της επαγόμενης από τη δεξαμεθαζόνη (DEX) έκφρασης των γονιδίων GILZ (glucocorticoid-induced leucine zipper) και FKBP5 (FK506 binding-protein) καθώς και από τα βασικά επίπεδα της πρωτεΐνης της ιντερλευκίνης 1β (IL-1β). Όσον αφορά τη καμπύλη ημερήσιας έκκρισης κορτιζόλης σιέλου, κατασκευάστηκε μετά από λήψη τεσσάρων δειγμάτων σιέλου και υπολογίστηκαν παράμετροι όπως η απόκριση της κορτιζόλης στην αφύπνιση (cortisol awaking response (CAR), η κλίση αφύπνισης (reactivity slope, slopeT0-T30), η ολική κλίση της καμπύλης (slopeT0-T23), η ημερήσια έκκριση κορτιζόλης (ως η συνολική περιοχή κάτω από την καμπύλη) (total area under the curve, AUCtotal) και η μεταβολή στην έκκριση της κορτιζόλης κατά την αφύπνιση (area under the curve with respect to increase, AUCi). Επιπλέον, προσδιορίστηκαν βιοχημικοί δείκτες [γλυκόζη νηστείας, ινσουλίνη, τριγλυκεριδία, γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη (HbA1), HDL- και LDL- χοληστερόλη], δείκτες φλεγμονής (επίπεδα ενδοκυττάριας IL-1β), δείκτες ενεργειακού μεταβολισμού [επίπεδα φωσφορυλιωμένης πρωτεΐνης ΑΜΡΚ (pAMPKα-Thr172), αντιπονεκτίνης πλάσματος και mRNA του γονιδίου της κινάσης της αφυδρογονάσης του πυροσταφυλικού οξέος (PDK4)] καθώς και η απόπτωση. Τέλος, τόσο οι παράμετροι του σηματοδοτικού μονοπατιού του GR όσο και οι παράμετροι της καμπύλης ημερήσιας έκκρισης κορτιζόλης σιέλου συσχετίστηκαν με δείκτες γλυκαιμίας, λιπιδαιμίας, φλεγμονής και ενεργειακού μεταβολισμού. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν ότι στον πληθυσμό των διαβητικών παρατηρούνται αυξημένες τιμές δείκτη μάζας σώματος (BMI), κοιλιακού λίπους, γλυκόζης νηστείας, ινσουλίνης, τριγλυκεριδίων και επίπεδων γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης (HbA1) ενώ μειωμένα είναι τα επίπεδα αντιπονεκτίνης, HDL- και LDL- χοληστερόλης καθώς και της έκφρασης του γονιδίου PDK4 σε σύγκριση με τον υγιή πληθυσμό. Τα δεδομένα αυτά συνάδουν με την παρουσία μεταβολικών διαταραχών στο ΣΔτ2. Επιπλέον, οι ασθενείς με ΣΔτ2 έχουν αυξημένα επίπεδα έκφρασης της ολικής πρωτεΐνης του υποδοχέα GR και του γονιδίου GRβ, ενώ εμφανίζουν μειωμένα πρωτεϊνικά επίπεδα του βιοδραστικού pGR-S211 συγκριτικά με τους υγιείς. Η αντίσταση στα γλυκοκορτικοειδή στους διαβητικούς ασθενείς επιβεβαιώθηκε μέσω της μειωμένης έκφρασης των γονιδίων GILZ και FKBP5 (GR-ελεγχόμενα γονίδια) καθώς και των αυξημένων πρωτεϊνικών επιπέδων IL-1β στα κύτταρα PBMC στη βασική κατάσταση. Επιπλέον, η πολυπαραγοντική ανάλυση στις καμπύλες δόσης-απόκρισης (gene-response curves) των γονιδίων GILZ και FKBP5 έδειξε ότι οι ασθενείς με ΣΔτ2 έχουν μειωμένη έκφραση των γονιδίων GILZ και FKBP5 και ενισχύει τα αποτελέσματα που δείχνουν την ύπαρξη αντίστασης στα GC στους ασθενείς με ΣΔτ2. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν διαταραχή στο σηματοδοτικό μονοπάτι του GR στο ΣΔτ2. Οι διαβητικοί ασθενείς παρουσιάζουν μειωμένο προφίλ έκκρισης κορτιζόλης σιέλου καθώς παρατηρούνται πεπλατυσμένες καμπύλες ημερήσιας έκκρισης κορτιζόλης σιέλου, μειωμένες τιμές CAR, slopeT0-T30 και AUCi και αυξημένες AUCtotal συγκριτικά με τους υγιείς. Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν τη διαταραχή στη λειτουργία του άξονα ΗΡΑ στους ασθενείς με ΣΔτ2. Τα αυξημένα πρωτεϊνικά επίπεδα IL-1β και τα μειωμένα pAMPKα-Thr172 στους ασθενείς με ΣΔτ2 συνάδουν με τη παρουσία αυξημένης φλεγμονής και μειωμένου ενεργειακού μεταβολισμού. Τέλος, οι διαβητικοί ασθενείς παρουσιάζουν χαμηλότερο ποσοστό απόπτωσης στα κύτταρα PBMC. Σημαντικό εύρημα της παρούσας μελέτης είναι οι στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των παραμέτρων του σηματοδοτικού μονοπατιού του GR με τις παραμέτρους της φλεγμονής και του μεταβολισμού, οι οποίες υποστηρίζουν ότι η διαταραγμένη λειτουργία του GR όπως αυτή προσδιορίστηκε στα κύτταρα PBMC (και πιθανόν αντανακλά τις δράσεις του GR στον άξονα ΗΡΑ) πιθανά να είναι παθογενετικός μηχανισμός που οδηγεί σε υπεργλυκαιμία, υπερλιπιδαιμία και σε αυξημένη φλεγμονή στο ΣΔτ2. Οι στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις που εντοπίστηκαν μεταξύ των παραμέτρων της καμπύλης ημερήσιας έκκρισης κορτιζόλης σιέλου και των παραμέτρων του μεταβολισμού και της φλεγμονής υποστηρίζουν ότι η υπερδραστηριότητα του άξονα ΗΡΑ μπορεί να οδηγήσει σε διαταραχές του μεταβολισμού και σε αυξημένη φλεγμονή στο ΣΔτ2. Όλες οι παραπάνω συσχετίσεις φαίνεται να επιβεβαιώνουν την αρχική υπόθεση της μελέτης σύμφωνα με την οποία στο ΣΔτ2 η διαταραγμένη λειτουργία του GR οδηγεί σε αντίσταση στα γλυκοκορτικοειδή στα κύτταρα PBMC η οποία πιθανόν αντανακλά τη μειωμένη λειτουργία του GR στον άξονα HPA και κατ’ επέκταση την υπερδραστηριότητά του και την υπερκορτιζολαιμία. Η υπερκορτιζολαιμία με τη σειρά της οδηγεί σε διαταραχές στους μεταβολικούς ιστούς (υπεργλυκαιμία, υπερλιπιδαιμία). Από την άλλη πλευρά, η αντίσταση στα γλυκοκορτικοειδή στα κύτταρα PBMC οδηγεί σε αυξημένη φλεγμονή. Συμπερασματικά, η μελέτη μας υποστηρίζει ότι οι διαταραχές στο σηματοδοτικό μονοπάτι του GR αποτελούν τον «βιολογικό σύνδεσμο» μεταξύ της υπερκορτιζολαιμίας και των μεταβολικών διαταραχών και της φλεγμονής που υπάρχει στον ΣΔτ2. Αναφορικά με τη σχέση της διατροφής και του ΣΔτ2 οι κατευθυντήριες οδηγίες άσκησης κλινικής πρακτικής τονίζουν τη σημασία της διατροφής στην πρόληψη και στην αντιμετώπιση του ΣΔτ2. Για το λόγο αυτό οι ασθενείς συχνά ενθαρρύνονται να χρησιμοποιούν εναλλακτικές γλυκαντικές ουσίες, όπως οι γλυκοζίτες στεβιόλης. Παρ’ όλο που η κατανάλωση γλυκοζιτών στεβιόλης θεωρείται ασφαλής, τελευταία δεδομένα υποστηρίζουν ότι η στεβιοσίδη (γλυκοζίτης στεβιόλης) εμφανίζει δράση διαμεσολαβούμενη μέσω αλληλουχιών απόκρισης στα GC (glucocorticoid response elements, GRE) όμοια με αυτή της δεξαμεθαζόνης σε μακροφάγα κύτταρα. Επειδή μία τέτοια δράση των γλυκοζιτών στεβιόλης θα είχε δυσμενείς επιδράσεις στο μεταβολισμό, ένας άλλος σημαντικός σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης των γλυκοζιτών στεβιόλης στο σηματοδοτικό μονοπάτι του GR σε υγιή άτομα. Συγκεκριμένα, μελετήσαμε τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων GILZ και FKBP5, της ολικής πρωτεΐνης του GR καθώς και τη κυτταρική διαμερισματοποίηση του GR σε κύτταρα PBMC από 4 υγιείς συμμετέχοντες μετά από έκθεση σε στεβιόλη, γλυκοζίτες στεβιόλης και Ελληνικής-προέλευσης εκχυλίσματος στέβιας. Επίσης εκτιμήθηκε η έκφραση των γονιδίων GILZ και FKBP5 στο περιφερικό αίμα υγειών ατόμων μετά από κατανάλωση ενός μείγματος υψηλής περιεκτικότητας σε γλυκοζίτες στεβιόλης. Οι ενώσεις στεβιόλη, γλυκοζίτες στεβιόλης και Ελληνικής-προέλευσης εκχύλισμα στέβιας δεν επηρεάζουν την έκφραση των γονιδίων GILZ και FKBP5, τα ολικά επίπεδα της πρωτεΐνης του GR ή την υποκυτταρική του διαμερισματοποίηση. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν ότι προαναφερθείσες υπο-εξέταση ενώσεις δεν εμφανίζουν GR-διαμεσολαβόυμενη δράση στα κύτταρα PBMC υγιών ατόμων και επομένως οι γλυκοζίτες στεβιόλης δεν αναμένεται να επηρεάζουν δυσμενώς τον μεταβολισμό.