Φαρμακολογική μελέτη των υποδοχέων του εκλυτικού παράγοντα κορτικοτροπίνης ως θεραπευτικών στόχων σε περιφερικά συστήματα και στον καρκίνο

Abstract

The Corticotropin Releasing Factor system has been characterized as the main regulator of the body's endocrine, behavioral and autonomic responses to stress, maintaining homeostasis at these levels. The CRF system, in addition to the hypothalamic neuropeptide CRF, consists of its homologous peptides, Urocortins (Ucn) I, II, and III, the two types of receptors CRF-R1 and CRF-R2, and the binding protein CRF- BP. The two receptors (CRF-Rs), which present different distribution and functions, both belong to class B of G-protein coupled receptors (GPCRs). The CRF system is located in many areas of the CNS which are involved in stress response actions. In each cell type, activation of the conjugated G-proteins leads to activation of multiple and different signaling pathways (such as the cAMP-PKA pathway, the PKC pathway, the ERK-MAPK pathway, the Akt / Protein Kinase B-PI- 3 pathway, the NF-κB, Nur1 / Nur77 signaling pathway, as well as other transcription factor-mediated signaling pathways). The selective binding of the CRF neuropeptides to the CRF-R subtypes leads to tissue specific signaling. The CRF ligand-receptor system is also extended to the periphery where it acts independently affecting a variety of cell types. It appears to hold multiple physiological regulatory roles and it is possible to be involved in stress-related pathogenic mechanisms. Furthermore, the CRF system has been shown to be involved in the regulation of the cell cycle and inflammation. In recent years, many studies have shown the association of the CRF system with various types of cancer. Based on studies using in vitro experimental models, the CRF neuropeptide family and its receptors have been suggested to be involved in the regulation of human cancinogenesis, metastasis, angiogenesis and immune escape of various malignancies. Μany studies provide scientific information regarding CRF system expression in a wide range of human malignancies, while further clarification of its biological role is essential in order to support the pathophysiological significance of these findings. Along with many others, our research team has published data providing evidence that both receptors of the CRF system are expressed in human breast cancer cells - derived either from breast cancer tumor biopsies or from experimental in vitro models of breast cancer cells - showing distinct distribution and transduction activity. These results point into their biological role in the development, homeostasis and migration capacity of breast cancer cells. The purpose of the present study was the investigation of CRF receptor expression and signaling in breast cancer and the understanding of the molecular mechanisms involved in the actions of the system in the periphery, specifically in carcinogenesis, and approaching them as potential therapeutic targets. It is an in vitro study, which started with the characterization of the MCF-7 human cancer cell line as a model for the CRF system in breast cancer. We first described the expression of the CRF receptors at the gene and protein levels, by the Reverse Transcription quantitative PCR (RT qPCR) and immunofluorescence (IF) respectively, under basal and hormone dependent conditions. Expression of CRF-R2 was detected in the MCF-7 cell membrane by immunofluorescence, whereas RT qPCR showed gene expression of both types of receptors, with CRF-R2a receptor being the major sybtype expressed. The regulation of CRF-Rs transcription in MCF-7 cells by estrogens (E2) was found opposite for the two CRF-Rs: it was noticed that CRF-R1 expression was increased, while CRF-R2 mRNA was decreased. Following, in order to understand the mechanism and regulation level of gene expression of CRF-R1 and CRF-R2, a study was performed on the methylation status of the gene promoters. Another interesting finding was the statistically significant demethylation of CRF-R1 promoter under treatment with the demethylating agent 5-AZA-CR, while no effect was noticed on the methylation status of the CRF-R2, demonstrating different regulation levels of gene expression. Under E2 treatment, no effect was noticed on the methylation status of both receptors. The results from the cancer cell line were evaluated in parallel with measurements in a panel of human breast cancer biopsies, where CRF-R1 methylation was significantly increased in human breast cancer biopsies samples positive for ER and / or PR expression. Furthermore, selective cell signaling was investigated in relation to growth parameters (cell proliferation, migration potential) of the cancer cell line MCF-7, and their interaction to hormonal induction. For these experiments, a system that monitors the cellular behavior through real-time measurements was used. Time and dose- dependent effects of the CRF system agonists or antagonists were evaluated. Regarding CRF-R2 in vitro activation, the specific and selective agonist UcnII was chosen. Cell proliferation assays in MCF-7 cells showed no effect of UcnII on cell growth under basal or E2- dependent induction. On the other hand, migration assays devealed a noticeable increase on the migration potential of MCF-7 cells under UcnII. The effect was abolished by the selective CRF-R2 antagonist, Astressin-2B, demonstrating the specific activation of the CRF-R2. Finally, the addition of UcnII in the E2-conditioned medium potentiated the migration potential of MCF-7 cells. Our data demonstrate an active "dialogue" between the CRF system and steroid hormones in breast cancer. Its elucidation may contribute to a complete picture of the complex molecular events which are involved in the hormone-dependent breast carcinogenesis and may contribute to the identification of new therapeutic targets.

Το σύστημα του Εκλυτικού Παράγοντα Κορτικοτροπίνης είναι ο κύριος ρυθμιστής των ενδοκρινικών, συμπεριφορικών και αυτόνομων αντιδράσεων του οργανισμού έναντι στο στρες, διατηρώντας την ομοιόσταση σε αυτά τα επίπεδα. Το σύστημα του CRF, εκτός από το υποθαλαμικό νευροπεπτίδιο CRF, αποτελείται από τα ομόλογα πεπτίδια των Ουροκορτινών (Ucn) Ι, ΙΙ και ΙΙΙ, δύο διακριτούς υποδοχείς, τους CRF-R1 και CRF-R2 καθώς και μια πρωτεΐνη δέσμευσης CRF-BP. Οι δυο υποδοχείς (CRF-Rs) που παρουσιάζουν διαφορετική κατανομή και λειτουργία, ανήκουν στην κατηγορία Β των υποδοχέων συζευγμένων με πρωτεΐνη G (GPCRs). Το σύστημα CRF εντοπίζεται σε πολλές περιοχές του ΚΝΣ που εμπλέκονται σε δράσεις απάντησης στο στρες. Σε κάθε κυτταρικό τύπο, η ενεργοποίηση των συζευγμένων G -πρωτεϊνών οδηγεί στην ενεργοποίηση πολλών και διαφορετικών μονοπατιών σηματοδότησης (για παράδειγμα έχουν αναφερθεί τα μονοπάτια cAMP-ΡΚΑ, PKC, ERK-MAPK, Akt/ Protein Kinase B-PI-3, NF-κΒ, Nur1 / Nur77 και άλλα). Έτσι, η επιλεκτική σύνδεση των νευροπεπτιδίων του συστήματος CRF με τον υποδοχέα και η δημιουργία του ενεργοποιημένου συμπλόκου προσδέτης- υποδοχέας οδηγεί σε ιστο-ειδική σηματοδότηση. Το σύστημα πεπτιδίων-υποδοχέων του CRF επεκτείνεται και στην περιφέρεια όπου δρουν ανεξάρτητα και επηρεάζουν ποικίλα οργανικά συστήματα ασκώντας κάποιο φυσιολογικό ρυθμιστικό ρόλο, ενώ πιθανολογείται η συμμετοχή του σε παθογενετικούς μηχανισμούς που σχετίζονται με το στρες. Ακόμη, το σύστημα CRF στην περιφέρεια φαίνεται να εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, καθώς και σε φαινόμενα φλεγμονής. Τα τελευταία χρόνια πολλές μελέτες έχουν αποδείξει την σχέση του συστήματος CRF με διάφορους τύπους καρκίνου. Με βάση μελέτες που χρησιμοποιούν in vitro πειραματικά μοντέλα, η οικογένεια των νευροπεπτιδίων του CRF και των υποδοχέων τους έχει προταθεί ότι συμμετέχουν στην καρκινογένεση, τη μετάσταση, την αγγειογένεση και την ανοσοδιαφυγή διαφόρων κακοηθειών. Αρκετές μελέτες καταδεικνύουν την έκφραση στοιχείων του συστήματος CRF σε ένα ευρύ φάσμα των ανθρώπινων κακοηθειών, ενώ αποσαφήνιση του βιολογικού του ρόλου είναι αναγκαία για τη στήριξη της παθοφυσιολογικής σημασίας των ευρημάτων αυτών. Δημοσιευμένα δεδομένα από τη δική μας και άλλες ερευνητικές ομάδες παρείχαν στοιχεία ότι και οι δύο υποδοχείς του συστήματος CRF εκφράζονται σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα μαστού - προερχόμενα είτε από βιοψίες όγκου ή από πειραματικά μοντέλα in vitro καρκινικών κυττάρων μαστού- παρουσιάζοντας διαφορετική κατανομή, υποδηλώνοντας κάποιο βιολογικό ρόλο στην ανάπτυξη, ομοιόσταση και μεταναστευτική ικανότητα αυτών των καρκινικών κυττάρων. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της έκφρασης και των βιολογικών δράσεων των υποδοχέων του CRF στον καρκίνο του μαστού με στόχο την κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην δράση του συστήματος στην περιφέρεια και την καρκινογένεση και προσεγγίζοντας τους ως πιθανούς θεραπευτικούς στόχους. Πρόκειται για μια in vitro μελέτη, που ξεκίνησε με το χαρακτηρισμό της ανθρώπινης καρκινικής κυτταρικής σειράς μαστού MCF-7 ως μοντέλου για τη μελέτη του συστήματος CRF στον καρκίνο του μαστού. Συγκεκριμένα, περιγράφηκε η έκφραση των υποδοχέων CRF σε γονιδιακό και πρωτεϊνικό επίπεδο μέσω της τεχνικής ποσοτικής PCR αντίστροφης μεταγραφής (RT qPCR) και ανοσοφθορισμού (IF) αντίστοιχα, υπό βασικές συνθήκες καλλιέργειας και υπό ορμονική επαγωγή. Εντοπίστηκε η έκφραση του CRF-R2 στην κυτταρική μεμβράνη των κυττάρων MCF-7 μέσω ανοσοφθορισμού, ενώ η ποσοτική RT-PCR έδειξε γονιδιακή έκφραση και των δύο τύπων υποδοχέων, με τον υποδοχέα CRF-R2a να εκφράζεται σε υψηλότερα επίπεδα. Η ρύθμιση της μεταγραφής των CRF-Rs σε κύτταρα MCF-7 υπό την επίδραση οιστρογόνων (Ε2) ήταν αντίθετη για τους δύο υποδοχείς: παρατηρήθηκε αύξηση στα μετάγραφα των υποδοχέων CRF-R1 ενώ το mRNA του CRF-R2 μειώθηκε. Επίσης, προκειμένου για την κατανόηση του μηχανισμού και επιπέδου ρύθμισης της έκφρασης των γονιδίων CRF-R1 και CRF-R2, έγινε μελέτη της κατάστασης μεθυλίωσης των υποκινητών των γονιδίων. Αξιοσημείωτο εύρημα είναι ότι ο υποκινητής του CRF-R1 βρέθηκε να απομεθυλιώνεται από τον γνωστό απομεθυλιωτικό παράγοντα 5-αζακυτιδίνη, ενώ δεν παρατηρήθηκε καμία επίδραση στην κατάσταση μεθυλίωσης του υποδοχέα CRF-R2, υποδηλώνοντας διαφορετικά επίπεδα ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης. Μετά από επίδραση με Ε2 δεν παρατηρήθηκε αλλαγή στην κατάσταση μεθυλίωσης αμφοτέρων των υποδοχέων. Τα αποτελέσματα από την καρκινική σειρά εκτιμήθηκαν παράλληλα με μετρήσεις σε δείγμα βιοψιών καρκίνου μαστού, όπου η μεθυλίωση του υποδοχέα CRF-R1 ήταν επίσης αυξημένη σε δείγματα που ήταν θετικά για την έκφραση ορμονικών υποδοχέων. Εν συνεχεία, διερευνήθηκε η κυτταρική σηματοδότηση των υποδοχέων σε σχέση με τις παραμέτρους ανάπτυξης (κυτταρικός πολλαπλασιασμός, μεταναστευτικό δυναμικό) της καρκινικής κυτταρικής σειράς MCF-7, και η αλληλεπίδραση με την ορμονική επαγωγή τους. Για τα πειράματα αυτά, χρησιμοποιήθηκε ένα σύστημα παρακολούθησης της κυτταρικής συμπεριφοράς σε πραγματικό χρόνο. Αξιολογήθηκε χρόνο- και δόσο-εξαρτώμενα η δράση ουσιών που δρουν ως αγωνιστές ή ανταγωνιστές στους υποδοχείς του συστήματος CRF. Πιο συγκεκριμένα, για την ενεργοποίηση των υποδοχέων CRF-R2 in vitro, επιλέχθηκε ο ειδικός και εκλεκτικός αγωνιστής UcnII. Στις αναλύσεις κυτταρικού πολλαπλασιασμού των κυττάρων MCF-7 δεν ανιχνεύθηκε καμία επίδραση της Ucn II, είτε σε βασικές συνθήκες ανάπτυξης είτε υπό επαγωγή με Ε2. Στα πειράματα παρακολούθησης της μεταναστευτικής ικανότητας των MCF-7, παρατηρήθηκε αύξηση του δυναμικού μετανάστευσης των MCF-7 κυττάρων υπό την επίδραση UcnII. H δράση αυτή καταργήθηκε από τον επιλεκτικό ανταγωνιστή του υποδοχέα CRF-R2, Astressin- 2B, καταδεικνύοντας ειδική ενεργοποίηση μέσω CRF-R2. Τέλος, η UcnII ενίσχυσε την επαγωγική δράση της Ε2 στη μεταναστευτική ικανότητα των MCF-7. Συνολικά, τα δεδομένα μας υποδεικνύουν ότι στον καρκίνο του μαστού υπάρχει ένας ενεργός «διάλογος» μεταξύ του CRF συστήματος και των στεροειδών ορμονών, ο οποίος πιθανόν να συμβάλλει στην ορμόνο- εξαρτώμενη καρκινογένεση και να έχει προεκτάσεις στην ταυτοποίηση νέων θεραπευτικών στόχων.