Μελέτη της σχέσης της οδού των νευροπεπτιδίων και της ενδοκυττάριας στεροειδογένεσης στον καρκίνο του προστάτη

Abstract

Abiraterone is an androgen biosynthesis inhibitor that selectively inhibits the enzyme CYP17 (17α- Hydroxylase and C17,20 -lyase) irreversibly. These CYP17 enzymes are required for the synthesis of testosterone in the body. Neuropeptides, like endothelin-1 (ET-1) and growth factors like Fibroblast Growth Factor -2 (FGF-2) and Hepatocyte Growth Factor (HGF) exist in high levels in prostate cancer cells and each factor individually has shown to contribute in the development and progression of prostate cancer. The aim of this study is to investigate whether the intracellular steroidogenesis triggered by ET-1, FGF-2 or HGF acts as a resistant mechanism in abiraterone’s action in prostate cancer. In this research, LNCaP and PC3 cells were used as in vitro models of androgen dependent (AD) (LNCaP) and androgen independent (AI) (PC3) prostate cancer. Cells were incubated with ET-1, FGF-2, HGF and/or abiraterone for 24 hours. After the period of 24 hours, the intracellular levels of 17-OH progesterone and dihydrotestosterone (DHT) were determined by ELISA method, proliferation rate was determined with MTT method and the expression of akt/p-akt, p-S6RP and p70S6 proteins was determined with Western Blot. According to our results, ET-1 has a regulatory role in steroidogenesis by mainly increasing the intracellular levels of DHT in PC3 cells but has no significant effect in the proliferation rate of both PC3 and LNCaP cells. The presence of different concentrations of abiraterone showed a decrease in intracellular levels of DHT in PC3 and LNCaP cells. Regarding the proliferation rate, LNCaP cells showed statistically significant decreases in proliferation in a dose-dependent way with all abiraterone concentrations that were used. Furthermore, PC3 cells showed a reduction in proliferation rate only when the highest concentration of abiraterone was used. Our findings highlight for the first time that abiraterone seems to have a pre-dominant role in the inhibition of cell proliferation and not only in the inhibition of steroidogenesis. Furthermore, with the experiments of co-administration of ET-1 and abiraterone, it was shown that ET-1 acts as an escape mechanism in abiraterone’s action via the increase of DHT levels. Additionally, abiraterone uses PI3Κ/akt pathway to inhibit cell proliferation in the presence of ET-1. Moreover, in the next steps of our research FGF-2 and HGF were found to decrease the intracellular levels of 17-OH progesterone in both cell lines, whereas HGF alone found to increase the intracellular levels of DHT only in PC3 cells. Interestingly however, the simultaneous exposure of cells to abiraterone and FGF-2 or HGF while it does not result to changes in the intracellular levels of 17-OH progesterone, found to result to increased intracellular levels of DHT. These findings suggest for the first time that ET-1, FGF-2 and HGF may act as escape mechanisms aiding the development of resistance to abiraterone. Their action by restoring intratumoral androgen synthesis in tumor environment may contribute to disease progression.

Η αμπιρατερόνη είναι ένας αναστολέας βιοσύνθεσης ανδρογόνων ο οποίος αναστέλλει μη αντιστρεπτά τη λειτουργία του ενζύμου CYP17 (17α- υδροξυλάση και C17,20 -λυάση). Το ένζυμο CYP17 απαιτείται για τη σύνθεση της τεστοστερόνης στον οργανισμό. Τα νευροπεπτίδια όπως η ενδοθηλίνη-1 (ΕΤ-1) και οι αυξητικοί παράγοντες όπως ο αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών τύπου 2 (FGF-2) και ο αυξητικός παράγοντας των ηπατοκυττάρων (HGF) υπάρχουν σε υψηλές συγκεντρώσεις στα καρκινικά προστατικά κύτταρα και το καθένα ξεχωριστά έχει δείξει να συμμετέχει στην ανάπτυξη και πρόοδο του καρκίνου του προστάτη. Σκοπός της παρούσας έρευνας είναι η μελέτη της επαγόμενης από ET-1, FGF-2 and HGF ενδοκυττάριας στεροειδογένεσης και του ρόλου της ως μηχανισμός αντίστασης στη δράση της αμπιρατερόνης στον καρκίνο του προστάτη. Στη παρούσα διδακτορική διατριβή χρησιμοποιήθηκαν καθιερωμένες κυτταρικές σειρές LNCaP και PC3 ως in vitro μοντέλα του ανδρογονο-εξαρτώμενου και ανδρογονο-ανεξάρτητου τύπου καρκίνου του προστάτη αντίστοιχα. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν με ET-1, FGF-2, HGF ή/και αμπιρατερόνη για 24 ώρες. Μετά το τέλος της επώασης, προσδιορίστηκαν τα ενδοκυττάρια επίπεδα 17-ΟΗ προγεστερόνης και διυδροτεστοστερόνης με τη μέθοδο ανοσοπροσρόφησης, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός με τη μέθοδο ΜΤΤ και η έκφραση των πρωτεϊνών akt/p-akt and p-S6RP, p70S6 με ανοσοαποτύπωση. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, η ΕΤ-1 έχει ρυθμιστικό ρόλο στη στεροειδογένεση κυρίως αυξάνοντας τα ενδοκυττάρια επίπεδα της DHT στα PC3 κύτταρα ενώ παρατηρήθηκε ότι δεν έχει σημαντική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των δύο καθιερωμένων κυτταρικών σειρών που μελετήσαμε. Η παρουσία αμπιρατερόνης με διάφορες συγκεντρώσεις έδειξε μία μείωση των ενδοκυττάριων επιπέδων DHT στα κύτταρα PC3 και LNCaP. Όσον αφορά το ρυθμό πολλαπλασιασμού, τα κύτταρα LNCaP έδειξαν στατιστικά σημαντικές μειώσεις στο πολλαπλασιασμό σ’ όλες τις συγκεντρώσεις αμπιρατερόνης που καλλιεργήθηκαν και μάλιστα με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Επίσης παρατηρήθηκε ότι τα κύτταρα PC3 έδειξαν μειωμένο πολλαπλασιασμό μόνο όταν σε αυτά χορηγήθηκε η μέγιστη συγκέντρωση αμπιρατερόνης. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν για πρώτη φορά ότι η αμπιρατερόνη κατέχει κυρίαρχο ρόλο στην αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και όχι μόνο στην αναστολή της στεροειδογένεσης. Επιπλέον, μέσω πειραμάτων συγχορήγησης αμπιρατερόνης και ΕΤ-1 παρατηρήθηκε ότι η ΕΤ-1 δρα σα μηχανισμός διαφυγής στη δράση της αμπιρατερόνης μέσω αύξησης των επιπέδων DHT. Συνεχίζοντας, η αμπιρατερόνη στοχεύει το μονοπάτι PI3Κ/akt για την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού παρουσία ΕΤ-1. Στη συνέχεια της έρευνας μας παρατηρήθηκε ότι οι παράγοντες FGF-2 και HGF μειώνουν τα ενδοκυττάρια επίπεδα 17-ΟΗ προγεστερόνης και στις δύο κυτταρικές σειρές, ενώ ο HGF μόνο βρέθηκε να αυξάνει τα ενδοκυττάρια επίπεδα DHT στα PC3 κύτταρα. Ενδιαφέρον προκαλεί ότι η συγχορήγηση αμπιρατερόνης με FGF-2 ή HGF βρέθηκε να προάγει την ενδοκυττάρια σύνθεση DHT χωρίς να επηρρεάζει τη σύνθεση 17-ΟΗ προγεστερόνης. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν για πρώτη φορά ότι η ΕΤ-1 και οι αυξητικοί παράγοντες FGF-2 και HGF δρουν ως μηχανισμοί διαφυγής συνεισφέροντας στην ανάπτυξη αντίστασης στην αμπιρατερόνη. Η δράση τους μέσω της αποκατάστασης της σύνθεσης ανδρογόνων στο περιβάλλον του όγκου μπορεί να συνεισφέρει στην πρόοδο της ασθένειας.