Heterogeneity in Salmonella individual cell behavior as variability source in population inactivation dynamics

Abstract

Most of the models in the field of Predictive Microbiology are developed on a deterministic basis describing the behavior of microbial populations as a whole without considering the individual cells. Only lately, in the context of Risk analysis framework the importance of individual cell heterogeneity as variability source was acknowledged. Bacterial cells within a clonal population can vary significantly in a number of phenotypic traits. With specific reference to microbial inactivation, a plethora of models is available with the D value concept being the cornerstone since it was initially introduced in 1920s. However, deterministic inactivation models do not take into account the variability of factors affecting microbial responses and the heterogeneity in the resistance of individual cells to lethal stresses. In the present thesis, single cell death behavior was assessed and evaluated as variability source in population inactivation behavior. A statistical modeling approach based on the probability distribution of individual cells inactivation times was applied and it was found that single cell time to death heterogeneity is a source of variability in population inactivation dynamics. The distribution of inactivation times was used to predict the inactivation of Salmonella enterica ser. Agona populations of various initial populations using Monte Carlo simulation. The results indicated that the D-value used in deterministic first order models is valid only for large populations. As the concentration decreases below 100 cells, however, the variability increases significantly. For small populations, D-value shows a high variability, originating from individual cell heterogeneity, and, thus, can be better characterized by a probability distribution rather than a uniform value. Individual cell inactivation behavior was assessed both directly, using a time lapse microscopic method and appropriate staining for cell viability, and indirectly. Predictive microbiology models, albeit their deterministic application, seem to be generally valid for predicting microbial behavior under optimal or lethal environmental conditions. However, when the conditions become complex and start to move towards the boundary of growth it is expected that population level models will show low performance in predicting the behavioral output of the whole population. Based on this consideration, the role of single cell heterogeneity at conditions close to the boundary of growth in population dynamics was investigated. The findings confirmed the expected high heterogeneity of individual cell responses which under certain environmental conditions may lead to the simultaneous coexistence of growing, surviving and dying fractions of the population. Overall, the study of microbial individuality and the quantitative assessment of the variability in microbial inactivation can constitute the basis for a stochastic inactivation model in order to develop or improve the risk-based designs for food processing or decontamination procedures and may contribute to the improvement of the accuracy of risk assessment models.

Τα περισσότερα μοντέλα στο πεδίο της Ποσοτικής Μικροβιολογίας περιγράφουν αιτιοκρατικά τη συμπεριφορά μικροβιακών πληθυσμών ως μία ολότητα χωρίς να λαμβάνονται υπόψη τα μεμονωμένα κύτταρα. Μόνο πρόσφατα, στο πλαίσιο της Ανάλυσης Επικινδυνότητας αναγνωρίστηκε η σημασία της ετερογένειας των μεμονωμένων κυττάρων. Βακτηριακά κύτταρα κλονικών πληθυσμών διαφέρουν σημαντικά σε ένα αριθμό φαινοτυπικών χαρακτηριστικών. Κάνοντας ιδιαίτερη αναφορά στη μικροβιακή αδρανοποίηση, μία πληθώρα μοντέλων είναι διαθέσιμα με την τιμή D να αποτελεί ακρογωνιαίο λίθο από τη δεκαετία του 1920. Tα αιτιοκρατικά μοντέλα αδρανοποίησης δεν λαμβάνουν υπόψη την παραλλακτικότητα παραγόντων που επηρεάζουν τις μικροβιακές αποκρίσεις και την ετερογένεια στην ανθεκτικότητα των μεμονωμένων κυττάρων σε θανατηφόρες καταπονήσεις. Στην παρούσα διατριβή, η συμπεριφορά αδρανοποίησης μεμονωμένων κυττάρων εκτιμήθηκε και αξιολογήθηκε ως πηγή παραλλακτικότητας στη συμπεριφορά αδρανοποίησης του μικροβιακού πληθυσμού. Μία στατιστική προσέγγιση μοντελοποίησης με βάση την κατανομή πιθανοτήτων του χρόνου θανάτου των μεμονωμένων κυττάρων εφαρμόστηκε και βρέθηκε ότι η ετερογένεια στον χρόνο αυτό αποτελεί πηγή παραλλακτικότητας για τη δυναμική της αδρανοποίησης του πληθυσμού. Η κατανομή των χρόνων αδρανοποίησης χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη της αδρανοποίησης διάφορων αρχικών πληθυσμών Salmonella enterica ορότυπος Agona μέσω της προσομοίωσης Monte Carlo. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η τιμή D είναι έγκυρη μόνο για υψηλούς μικροβιακούς πληθυσμούς. Η παραλλακτικότητα είναι ελάχιστη στην προβλεπόμενη συμπεριφορά αδρανοποίησης για συγκεντρώσεις μέχρι 100 κυττάρων. Ωστόσο, καθώς η μικροβιακή συγκέντρωση μειώνεται κάτω από τα 100 κύτταρα, η παραλλακτικότητα αυξάνεται σημαντικά. Σε αυτά τα επίπεδα πληθυσμού, η τιμή D εμφανίζει έντονη παραλλακτικότητα, η οποία προέρχεται από την ετερογένεια των μεμονωμένων κυττάρων και έτσι, χαρακτηρίζεται καλύτερα από μία κατανομή πιθανοτήτων παρά από μία μεμονωμένη τιμή. Η συμπεριφορά αδρανοποίησης μεμονωμένων κυττάρων εκτιμήθηκε τόσο έμμεσα όσο και άμεσα μέσω μίας μικροσκοπικής μεθόδου time lapse σε συνδυασμό με την κατάλληλη χρώση-δείκτη για την κυτταρική βιωσιμότητα. Τα μοντέλα του πεδίου της μικροβιολογίας τροφίμων, μολονότι εφαρμόζονται αιτιοκρατικά, φαίνεται ότι γενικά παρέχουν έγκυρες προβλέψεις της μικροβιακής συμπεριφοράς κάτω από ιδανικές ή θανατηφόρες συνθήκες. Ωστόσο, όταν οι συνθήκες γίνονται πιο σύνθετες και τείνουν προς το όριο της ανάπτυξης αναμένεται ότι τα αιτιοκρατικά μοντέλα που βασίζονται στο επίπεδο του πληθυσμού επιδεικνύουν χαμηλή επίδοση όσον αφορά στην πρόβλεψη της συμπεριφοράς ολόκληρου του πληθυσμού. Με βάση αυτή την θεώρηση, διερευνήθηκε ο ρόλος της ετερογένειας των μεμονωμένων κυττάρων σε περιβαλλοντικές συνθήκες κοντά στο όριο της ανάπτυξης στη δυναμική του πληθυσμού. Τα ευρήματα επιβεβαίωσαν την αναμενόμενη ετερογένεια στις αποκρίσεις των μεμονωμένων κυττάρων γεγονός το οποίο κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες μπορεί να οδηγήσει σε ταυτόχρονη συνύπαρξη ενός διαιρούμενου μέρους του πληθυσμού, ενός το οποίο απλά επιβιώνει και ενός το οποίο αδρανοποιείται. Συνολικά, η μελέτη της μικροβιακής ατομικότητας και η ποσοτική εκτίμηση της παραλλακτικότητας στη μικροβιακή αδρανοποίηση μπορούν να αποτελέσουν την βάση για τα στοχαστικά μοντέλα αδρανοποίησης με σκοπό την ανάπτυξη ή τη βελτίωση των σχεδιασμών των επεξεργασιών τροφίμων και των διαδικασιών εξυγίανσης σε μία προσέγγιση με βάση την επικινδυνότητα καθώς και μπορούν να συμβάλλουν στην βελτίωση της ακρίβειας των μοντέλων εκτίμησης επικινδυνότητας.