Μελέτη της εξειδίκευσης και του μηχανισμού λειτουργίας των αμινοπεπτιδασών ERAP1, ERAP2 και IRAP

Abstract

ERAP1, ERAP2 and IRAP aminopeptidases are important enzymes of the human adaptive immune system and play key roles in the antigen processing and presentation pathway. Their primary function is to produce mature antigenic epitopes which can bind onto MHC class I molecules. Therecognition of MHCI-epitope complexes by cytotoxic T lymphocytes results in the destruction of the infected or transformed cells. In the present thesis we focused on elucidating the mechanism of action and inhibition of ERAP1, the enzyme with the most profound effect in antigen processing. Specifically, by using recombinant DNA technology we expressed ERAP1 alleles with different polymorphic contents and studied their influence on the enzyme function. We demonstrated that ERAP1 polymorphisms can act by two distinct but synergetic mechanisms: influencing the enzyme activity or affecting the substrate length specificity. Furthermore, we analyzed how the conformational change of ERAP1 can affect its enzymatic activity. For that purpose we expressed recombinant ERAP1 variants, with perturbed inter-domain interactions responsible for stabilizing the closed conformation of the enzyme. Our results showed that these interactions are important for conformational plasticity, active site structural integrity and the specialization of the enzyme for antigenic peptide precursors. Finally, due to the emerging importance of pharmaceutical inhibition of these aminopeptidases, we screened, evaluated and characterized a set of non-peptidic compounds as potential inhibitors of these enzymes. Our results showed that the pharmaceutical compound Thimerosal is a potent and selective inhibitor of ERAP1.

Οι αμινοπεπτιδάσες ERAP1, ERAP2 και IRAP αποτελούν σημαντικά συστατικά του επίκτητου ανοσοποιητικού συστήματος του ανθρώπου, συμμετέχοντας ενεργά στους μηχανισμούς αντιγονοπαρουσίασης. Λειτουργία τους είναι η παραγωγή ώριμων αντιγονικών επιτόπων, κατάλληλων για πρόσδεση σε μόρια τάξης I του MHC. Τα σύμπλοκα επιτόπων-MHCIαναγνωρίζονται στη συνέχεια από κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα, με αποτέλεσμα την εξάλειψη μολυσμένων ή μετασχηματισμένων κυττάρων. Στην παρούσα διατριβή εστιάσαμε τη μελέτη μας στην ανάλυση του μηχανισμού δράσης και αναστολής της ERAP1, του ενζύμου με τη μεγαλύτερη συνεισφορά στην επεξεργασία αντιγόνων. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιώντας τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA εκφράσαμε αλλήλια ERAP1 με διαφορετικούς συνδυασμούς πολυμορφισμών και μελετήσαμε την επίδρασή τους στη λειτουργία του ενζύμου. Διαπιστώσαμε ότι οι πολυμορφισμοί ασκούν τη δράση τους μέσω δύο ξεχωριστών αλλά συνεργιστικών μηχανισμών: επηρεάζοντας τη δραστικότητα του ενζύμου ή την προτίμηση των υποστρωμάτων του αναλόγως του μήκους τους. Στη συνέχεια, επικεντρωθήκαμε στη λειτουργική σημασία αλλαγής διαμορφώσεων της ERAP1. Για το σκοπό αυτό εκφράσαμε ανασυνδυασμένα αλλήλια ERAP1, στα οποία διαταράξαμε με τοποειδική μεταλλαξιγένεση ένα σύνολο αλληλεπιδράσεων που σταθεροποιούν την κλειστή διαμόρφωση του ενζύμου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι αλληλεπιδράσεις αυτές είναι κρίσιμες για τη δομική πλαστικότητα του ενζύμου, τη δομική οργάνωση του ενεργού κέντρου καθώς και ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξειδίκευση του ενζύμου για πρόδρομα αντιγονικά πεπτίδια. Τέλος, λόγω της αναδυόμενης φαρμακευτικής σημασίας της αναστολής της ERAP1, έγινε διαλογή, αξιολόγηση καιχαρακτηρισμός του μηχανισμού ενός συνόλου μη πεπτιδικών ενώσεων ως πιθανών αναστολέων αυτών των ενζύμων. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι η φαρμακευτική ουσία Thimerosal είναι ισχυρός και εκλεκτικός αναστολέας της ERAP1.