Παραγωγή ικριώματος τραχείας για την αντιμετώπιση σοβαρών παθήσεων της αναπνευστικής οδού

Abstract

Regenerative medicine is an evolving domain that combines tissue engineering and cell therapies and is now considered that may open up new prospects for a promising future in medical science. The aim of this thesis is to produce tracheal scaffold in order to treat serious diseases of the respiratory system without the use of bioreactor. The acquired or iatrogenic injury of the airways and particularly of trachea is relatively common and is considered to be deadly for the patient. Therefore, the reconstruction/replacement of portions of the trachea due to injury, damage or congenital anomaly and the need to strengthen tissue regeneration are still a wide field of research. To carry out the present study, rat tracheas were resected and decellularised with protocols that have already been used before. The absence of genetic material and the maintenance of the tissue morphology were then tested. The test was performed by evaluation of decellularisation through histological, quantitative and qualitative control of scaffolds.Trachea tissues were stained with Hematoxylin-Eosin, Toloudine Blue, Masson's Trichrome, Elastic Van Gieson and 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Furthermore, DNA, glycosaminoglycans and collagen were quantitated in both native and decellularised tracheas. Also, a qualitative evaluation of tissues was performed using scanning electron microscopy. These tests confirmed the removal of the nuclear and cellular elements of the tissue and the maintenance of the extracellular matrix of scaffolds. Ultimate Tensile Strength (UTS) was applied to cartilage rings and strips of native and decellularised tissue. Compared to the former, the latter displayed significantly increased failure strain, but decreased failure stress and peak elastic modulus in the longitudinal direction. There were no differences between native and decellularised tracheas in the circumferential direction. In native tracheas, greater parameter values were found longitudinally than circumferentially, with all directional differences attaining high statistical significance. Unlike native tracheas, there were no directional differences in failure stress in decellularised tracheas, while failure strain was significantly higher longitudinally and peak elastic modulus was significantly higher circumferentially. Biomechanical testing revealed certain differences in failure parameters between native and decellularised tracheas,suggesting that the latter were significantly weaker and softer, but more extensible than the former, albeit only longitudinally. Subsequently, in vitro cytotoxic test of scaffolds was performed using human mesenchymal cells (hMSCs). Successful cell growth was observed around the decellularised scaffold suggesting the removal of most toxic biological and chemical elements that would inhibit cell proliferation and growth. Finally, following the above tests, in vivo biocompatibility and recellularisation test of the decellularised scaffolds was performed in rats (n = 8) for 1 month. The decellularised tracheas were implanted in the rat back, while biopsies were taken to assess tracheal recellularisation and the risk of immune response. Following euthanasia of rats, histological and phenotypic testing was performed on implanted tissues. Control for the expression of CD3, CD4, CD11-b immunological markers and S100 marker was performed as well as hematoxylin-eosin staining for confirmatory check. No expression of CD4 cells was observed in decellularised tissue, whereas the presence of CD3 and CD11b was very low. Therefore, decellularised trachea implants showed a low immune response, which was also confirmed by histological staining of hematoxylin and eosin (H&E). S100 expression and presence of fibroblast-like cells was also observed, a characteristic of tissue regeneration and recellularization. Cartilage tissue exhibits elements of regeneration indicating that the body can function as a bioreactor in order to restore tissue structure and function. The above indicates initiation of tissue regeneration and the low immunogenicity of the decellularised scaffold. The aim of this thesis was to create a cellular, tissue-engineered airway through the process decellularisation and recellularisation, without the use of a bioreactor, that could have the structure and function of native tissue without the risk of an immune response. The purpose of this study was to evaluate the decellularised scaffold and study whether the organism can function as a bioreactor in order to restore the structure and function of the tissue so that in future there will be successful functional solutions for serious clinical disorders of the respiratory tract.

Η αναγεννητική ιατρική είναι ένας εξελισσόμενος τομέας που συνδυάζει την ιστομηχανική και τις κυτταρικές θεραπείες και θεωρείται πλέον ότι μπορεί να ανοίξει νέες προοπτικές για ένα πολλά υποσχόμενο μέλλον στην ιατρική επιστήμη. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η παραγωγή ικριώματος τραχείας για την αντιμετώπιση σοβαρών παθήσεων της αναπνευστικής οδού χωρίς τη χρήση βιοαντιδραστήρα. Ο επίκτητος ή ιατρογενής τραυματισμός των αεραγωγών και συγκεκριμένα της τραχείας είναι σχετικά συχνός και θεωρείται θανατηφόρος για τον ασθενή. Ως εκ τούτου, η αποκατάσταση/αντικατάσταση τμημάτων της τραχείας εξαιτίας είτε τραυματισμού είτε βλάβης είτε συγγενούς ανωμαλίας και η ενίσχυση της αναγεννητικότητας των ιστών συνεχίζει να αποτελεί ευρύ ερευνητικό πεδίο. Για την πραγματοποίηση της παρούσας μελέτης αφαιρέθηκαν οι τραχείες από επίμυες και αποκυτταροποιήθηκαν με ήδη εφαρμοσμένα πρωτόκολλα αποκυτταροποίησης. Στη συνέχεια, ελέγχθηκε η απουσία γενετικού υλικού και η διατήρηση της μορφολογίας του ιστού. Ο έλεγχος πραγματοποιήθηκε με αξιολόγηση της αποκυτταροποίησης με ιστολογικό, ποσοτικό και ποιοτικό έλεγχο των ικριωμάτων. Πραγματοποιήθηκαν χρώσεις των ιστών με Αιματοξυλίνη-Ηωσίνη, Τολουιδίνη μπλε, τρίχρωμη χρώση (Masson’s Trichrome), Elastic Van Gieson και 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Έπειτα, ποσοτικοποιήθηκαν το DNA, οι γλυκοζαμινογλυκάνες και το κολλαγόνο τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε αποκυτταροποιημένες τραχείες. Επίσης, έγινε ποιοτική αξιολόγηση των ιστών με τη χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης. Οι παραπάνω έλεγχοι επιβεβαίωσαν την απομάκρυνση πυρηνικών και κυτταρικών στοιχείων του ιστού ενώ παράλληλα έδειξαν τη διατήρηση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας των ικριωμάτων. Εμβιομηχανικός έλεγχος πίεσης-επιμήκυνσης (Ultimate Tensile Strength-UTS) εφαρμόστηκε σε χόνδρινους δακτυλίους και λωρίδες εγγενούς και αποκυτταροποιημένου ιστού. Ο αποκυτταροποιημένος ιστός εμφάνισε σημαντικά αυξημένη παραμόρφωση αστοχίας αλλά μειωμένη τάση αστοχίας και μέγιστο μέτρο ελαστικότητας σε σύγκριση με τον εγγενή ιστό, μόνο στη διαμήκη κατεύθυνση. Δεν υπήρχαν διαφορές μεταξύ των εγγενών και των αποκυτταροποιημένων τραχειών στην περιφερειακή κατεύθυνση. Στις εγγενείς τραχείες, μεγαλύτερες τιμές παραμέτρων βρέθηκαν κατά μήκος σε σχέση με την περιφέρεια, με όλες τιςκατευθυντήριες διαφορές να έχουν μεγάλη στατιστική σημασία. Σε αντίθεση με τις εγγενείς τραχείες, δεν υπήρχαν διαφορές στην κατεύθυνση όσον αφορά στην τάση αστοχίας στις αποκυτταροποιημένες τραχείες, ενώ η παραμόρφωση αστοχίας ήταν σημαντικά υψηλότερη κατά μήκος και το μέγιστο μέτρο ελαστικότητας ήταν σημαντικά υψηλότερο περιφερειακά-εγκάρσια. Οι εμβιομηχανικές δοκιμές αποκάλυψαν ορισμένες διαφορές στις παραμέτρους αστοχίας μεταξύ εγγενών και αποκυτταροποιημένων τραχειών, υποδηλώνοντας ότι οι τελευταίες ήταν σημαντικά ασθενέστερες και πιο μαλακές αλλά πιο εκτάσιμες από τις πρώτες, αν και μόνο κατά μήκος. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε in vitro κυτταροτοξικός έλεγχος των ικριωμάτων με τη χρήση ανθρώπινων μεσεγχυματικών κυττάρων (hMSCs). Παρατηρήθηκε επιτυχής ανάπτυξη των κυττάρων γύρω από το αποκυτταροποιημένο ικρίωμα υποδηλώνοντας την απομάκρυνση μεγάλου μέρους των τοξικών βιολογικών και χημικών στοιχείων που θα ανέστειλλαν το κυτταρικό πολλαπλασιασμό και ανάπτυξη. Τέλος, μετά τη διεξαγωγή των ανωτέρω ελέγχων, πραγματοποιήθηκε in vivo δοκιμασία ελέγχου βιοσυμβατότητας και επανακυτταροποίησης του αποκυτταροποιημένου ικριώματος σε επίμυες (n=8) για χρονικό διάστημα 1 μήνα. Οι αποκυτταροποιημένες τραχείες εμφυτεύτηκαν στη ράχη επίμυων ενώ βιοψίες λήφθηκαν ώστε να ελεγχθεί η επανακυτταροποίηση της τραχείας και η ανοσολογική απόκριση. Μετά την ευθανασία των επίμυων διεξήχθη ιστολογικός και φαινοτυπικός έλεγχος στους εμφυτευμένους ιστούς. Πραγματοποιήθηκε σήμανση με τους ανοσολογικούς δείκτες CD3, CD4, CD11-b και S100 καθώς και χρώση με αιματοξυλίνη-εωσίνη για επιβεβαιωτικό έλεγχο. Στις αποκυτταροποιημένες τραχείες δε φάνηκε καθόλου έκφραση του δείκτη CD4 ενώ πολύ μικρή ήταν η παρουσία των CD3 και CD11b. Επομένως, οι αποκυτταροποιημένες τραχείες που εμφυτεύθηκαν παρουσίασαν μικρή ανοσολογική απάντηση γεγονός που επιβεβαιώνεται και από τη ιστολογική χρώση αιματοξυλίνης και εοσίνης (H&E). Επίσης παρατηρήθηκε η έκφραση του S100 και η παρουσία κυττάρων που προσομοιάζουν ινοβλάστες, χαρακτηριστικό αναγέννησης και επανακυτταροποίησης του ιστού. Ο χόνδρινος ιστός παρουσίασε στοιχεία ανάπλασης και αναγέννησης υποδεικνύοντας πως ο οργανισμός μπορεί να λειτουργήσει ως βιοαντιδραστήρας για να αποκατασταθεί η δομή και η λειτουργία του ιστού Τα παραπάνω υποδεικνύουν την έναρξη ιστικήςαναγέννησης και την ύπαρξη χαμηλής ανοσογονικότητας του αποκυτταροποιημένου ικριώματος. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η δημιουργία ενός κυτταρικού, ιστομηχανικού αεραγωγού μέσω αποκυτταροποίησης και επανακυτταροποίησης, χωρίς τη χρήση βιοαντιδραστήρα, ο οποίος να μπορεί να έχει τη δομή και τη λειτουργία του εγγενούς ιστού χωρίς να υπάρχει ο κίνδυνος ανοσολογικής απόκρισης. Αυτή η έρευνα είχε ως σκοπό να αξιολογήσει το αποκυτταροποιημένο ικρίωμα και να μελετήσει αν ο οργανισμός μπορεί να λειτουργήσει ως βιοαντιδραστήρας για να αποκατασταθεί η δομή και η λειτουργία του ιστού ώστε στο μέλλον να υπάρχουν επιτυχείς λειτουργικές λύσεις για σοβαρές κλινικές διαταραχές της αναπνευστικής οδού.