Genes involved in biosynthesis of hydroxytyrosol in olive fruit and heterologous expression in Arabidopsis thaliana and Saccharomyces cerevisiae

Abstract

The olive tree, Olea europaea, is a widely cultivated crop, known for the high nutritional value of the produced olive oil, which is rich in phenolic compounds with antioxidant activity and health advantages. Ηydroxytyrosol (HT), has anti-inflammatory, antimicrobial, antihyperlipidemic properties and contributes to the plant’s defense. The HT biosynthetic pathway is not fully elucidated. Two suggested routes start from tyrosine including four enzymes that catalyze the formation of intermediate compounds. Tyrosol is produced as the last precursor of HT. There is an increasing interest in HT heterologous production in microorganisms like yeast. Since tyrosine is an HT precursor, increasing the endogenous yeast tyrosine levels could boost HT production. HT is also involved in plant defense, therefore there is interest to investigate whereas other plants, like Arabidopsis thaliana, would be more resistant to pathogens when heterologously expressing HT. Oleuropein is another important olive antioxidant. It belongs to secoiridoids, a class of phenolic compounds produced from secologanin. The secologanin biosynthetic genes have not been identified in the olive cultivar Koroneiki. The aims of this dissertation were (a) the identification of genes potentially involved in HT and oleuropein biosynthesis in Koroneiki using transcriptome analysis, as well as the monitoring of gene expression and metabolite accumulation during fruit development, (b) the engineering of yeast strains to overproduce tyrosine for exploitation in the heterologous production of HT using olive genes and (c) the development of Arabidopsis thaliana plants carrying olive transgenes for reconstitution of the HT biosynthetic pathway. To accomplish the goals mentioned above, we employed sequencing, metabolic engineering, and genetic approaches. Genes potentially encoding enzymes capable of forming more than one HT biosynthetic pathways were expressed in Koroneiki young fruits. Transcripts of genes potentially involved in the secologanin biosynthetic pathway were also identified in the olive transcriptome. The relative expression levels of the HT and secologanin biosynthetic genes were measured at five developmental stages of the fruit for four successive years. The study revealed a uniform pattern for all genes in each year, where expression was highest in the youngest fruit, dropping during maturation. HT, tyrosol and oleuropein levels, quantified at the same five developmental stages of the fruit, revealed higher accumulation in the young fruit, except for HT concentration, which shows an increase in the fully mature black fruit. Tyrosine endogenous levels in yeast were considered insufficient for the heterologous production of HT; therefore, novel yeast strains exhibiting up to a 4,5-fold increase in tyrosine levels were produced. The insertion of the olive HT biosynthetic genes in the new yeast strains resulted in significant amounts of tyrosol detected only in the strain with elevated tyrosine production and the olive transgenes. Insertion of olive HT biosynthetic genes or homologous bacterial transgenes in Arabidopsis thaliana resulted in the production of 28 transgenic plants of 3 different lines. The metabolite profile of plants from each transgenic line was compared to the wild-type plants and new compounds were detected, although none was identified as HT or tyrosol.

Το ελαιόδενδρο, Olea europaea, είναι ένα ευρέως καλλιεργούμενο είδος, γνωστό για την υψηλή διατροφική αξία του ελαιολάδου που παράγει, πλούσιο σε φαινολικές ενώσεις με αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Ένα από τα πιο σημαντικά αντιοξειδωτικά της ελιάς είναι η υδροξυτυροσόλη (ΥΤ), η οποία επιπλέον έχει αντιφλεγμονώδεις, αντιμικροβιακές. αντι-υπερλιπιδαιμικές ιδιότητες και συνεισφέρει στην άμυνα του φυτού. Το βιοσυνθετικό μονοπάτι της ΥΤ στο ελαιόδενδρο δεν είναι πλήρως αποσαφηνισμένο. Υπάρχουν δύο προτεινόμενες οδοί, οι οποίες ξεκινούν από την τυροσίνη και περιλαμβάνουν τέσσερα ένζυμα, που συνθέτουν διαφορετικούς ενδιάμεσους μεταβολίτες. Υπάρχει ένα αυξανόμενο ενδιαφέρον για την ετερολόγη παραγωγή ΥΤ σε μικροοργανισμούς όπως η ζύμη. Η εισαγωγή βιοσυνθετικών γονιδίων της ελιάς θα μπορούσε να οδηγήσει σε παραγωγή ΥΤ. Καθώς η τυροσίνη είναι η πρόδρομη ένωση της ΥΤ, η αύξηση των ενδογενών επιπέδων τυροσίνης δυνητικά θα ενισχύσει την παραγωγή της ΥΤ. Η ΥΤ εμπλέκεται στη φυτική άμυνα άρα θα είχε ενδιαφέρον η διερεύνηση της πιθανής ανθεκτικότητας σε παθογόνα άλλων φυτών, όπως το Arabidopsis thaliana, που θα παράγουν ετερόλογα ΥΤ. Η ελευρωπαΐνη είναι ένα ακόμα αντιοξειδωτικό της ελιάς. Ανήκει στα σεκοϊριδοειδή, μια κατηγορία φαινολικών ενώσεων, τα οποία παράγονται από τη σεκολογανίνη. Τα βιοσυνθετικά γονίδια της σεκολογανίνης δεν έχουν βρεθεί στην ποικιλία ελιάς Κορωνέικη. Οι στόχοι της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν: α) ο εντοπισμός γονιδίων που δυνητικά εμπλέκονται στα βιοσυνθετικά μονοπάτια της ΥΤ και της ελευρωπαΐνης στην Κορωνέικη μέσω ανάλυσης του μεταγραφώματος, καθώς και η μελέτη της σχετικής γονιδιακής έκφρασης και της συσσώρευσης των αντίστοιχων μεταβολιτών κατά την ωρίμανση του καρπού, β) η τροποποίηση στελεχών ζύμης για την υπερπαραγωγή τυροσίνης, ώστε να χρησιμοποιηθούν για την ετερόλογη βιοσύνθεση ΥΤ και γ) η δημιουργία διαγονιδιακών φυτών Arabidopsis thaliana με γονίδια της ελιάς για την ανασύσταση της βιοσυνθετικής οδού της ΥΤ. Για την επίτευξη των παραπάνω στόχων εφαρμόσθηκαν τεχνικές αλληλούχησης, μεταβολικής μηχανικής και γενετικής. Στον νεαρό καρπό ελιάς ποικιλίας Κορωνέικης εκφράζονται γονίδια που δυνητικά κωδικοποιούν ένζυμα ικανά να σχηματίσουν πάνω από ένα βιοσυνθετικό μονοπάτι της ΥΤ. Στο μεταγράφωμα της ελιάς εντοπίστηκαν επίσης μετάγραφα των γονιδίων που δυνητικά εμπλέκονται στη βιοσύνθεση της σεκολογανίνης. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των βιοσυνθετικών γονιδίων της ΥΤ και της σεκολογανίνης, καθώς και τα επίπεδα της ΥΤ, της τυροσόλης και της ελευρωπαΐνης, ποσοτικοποιήθηκαν σε πέντε αναπτυξιακά στάδια του καρπού για τέσσερα συναπτά έτη. Η μελέτη τους αποκάλυψε ένα σταθερό πρότυπο, με υψηλότερη έκφραση και ποσότητα στον νεαρό καρπό, και μειούμενη κατά την ωρίμανση. Στη ζύμη τα ενδογενή επίπεδα τυροσίνης θεωρήθηκαν ανεπαρκή για την ετερόλογη παραγωγή ΥΤ, ως εκ τούτου δημιουργήθηκαν νέες κυτταρικές σειρές που παρουσίασαν μέχρι 4,5 φορές άνοδο των επιπέδων ενδοκυττάριας τυροσίνης. Η εισαγωγή βιοσυνθετικών γονιδίων ΥΤ της ελιάς σε ένα νέο στέλεχος ζύμης οδήγησε στην παραγωγή σημαντικών επιπέδων τυροσόλης, ανιχνεύσιμα μόνο στο στελέχος που υπερπαράγει τυροσίνη και φέρει τα διαγονίδια της ελιάς. Η εισαγωγή βιοσυνθετικών γονιδίων της ΥΤ της ελιάς ή ομόλογων βακτηριακών διαγονιδίων στο Arabidopsis thaliana οδήγησε στη δημιουργία 28 διαγονιδιακών φυτών, 3 διαφορετικών γενοτύπων. Το προφίλ των μεταβολιτών από τα διαγονιδιακά φυτά συγκρίθηκε με φυτά αγρίου τύπου και εντοπίστηκαν νέες ενώσεις, αλλά καμία δεν ταυτοποιήθηκε ως τυροσόλη ή ΥΤ.