Ο ρόλος της myospryn in vivo και η σημασία της αλληλεπίδρασής της με τη δεσμινή

Abstract

The TRIM-like protein myospryn is a desmin associated protein, initially identified as an associated partner to the BLOC-1 (Biogenesis of Lysosomes Related Organelles Complex 1) protein dysbindin, implicating its potential involvement in vesicle trafficking and organelle biogenesis and/or positioning. Myospryn is also an AKAP protein (A Kinase Anchoring Protein) raising the possibility that together with desmin and other cytoskeletal and signaling proteins, it could participate in the subcellular targeting of protein kinase A (PKA) activity in striated muscle. Considering the previous data, we sought to unveil the role of myospryn in heart and the biological significance of myospryn-desmin association. To address this we have used both in vivo and in vitro strategies. With in vitro approaches we have studied the importance of desmin-AKAP/myospryn interaction in the regulation of PKA pathway. We used neonatal cardiomyocytes and showed that desmin deficiency affects at least the beating rate, the recycling of the b2 adrenergic receptor and cyclic-AMP accumulation, suggesting a potential role of desmin and desmin-AKAP/myospryn association in proper β-AR/adenylate cyclase coupling and receptor desensitization that might contribute to heart failure development due to desmin deficiency. With in vivo approaches, we further elucidated the role of myospryn in heart and the biological significance of myospryn-desmin association. We genetically inactivated myospryn in mice via homologous recombination in embryonic stem cells (ESCs) with the efficiency of homologous recombination being only 0,9%. This is the first worldwide description of the generation of myospryn knockout mouse, which by itself demonstrated that, the absence of myospryn does not cause embryonic lethality in mice. The absence of myospryn causes dilated cardiomyopathy, characterized by wall thinning and dilation, abnormalities in heart chambers (by-atrial dilation), fibrosis and compromised cardiac function. Ultrastructural analyses revealed that the sarcomere organization is not obviously affected, with the myofibrils being well packaged and organized, however, intercalated disk (ID) integrity is impaired. The most important finding of the present study is the severe mitochondrial defects with abnormal internal mitochondrial vacuoles and extensive cristolysis, often accompanied by swollen sarcoplasmic reticulum (SR) and T-tubules, without excluding abnormal mitophagy. Overall, our data imply a potential link of myospryn together with desmin to SR-mitochondrial physical and functional cross-talk through ΜΑΜs (mitochondrial-associated ER membranes).

Η TRIM-like πρωτεΐνη myospryn αποτελεί μια αλληλεπιδρώσα πρωτεΐνη της δεσμίνης και αρχικά αναγνωρίστηκε ως συνδεδεμένος συνεργάτης της πρωτεΐνης dysbindin του BLOC-1 (Biogenesis of Lysosomes Related Organelles Complex 1), εμπλέκοντάς την στη διαμετακίνηση κυστιδίων και τη βιογένεση και/ή την τοπολόγηση οργανιδίων. Η myospryn αντιπροσωπεύει επίσης μια μυοειδική πρωτεΐνη AKAP (πρωτεΐνη πρόσδεσης στην κινάση), αυξάνοντας την πιθανότητα ότι μαζί με τη δεσμίνη και άλλα κυτταροσκελετικά και σηματοδοτικά μόρια θα μπορούσε να συμμετάσχει στην υποκυτταρική στόχευση της δραστικότητας της πρωτεϊνικής κινάσης Α (ΡΚΑ) στο γραμμωτό μυ. Λαμβάνοντας υπόψη τα προηγούμενα δεδομένα, επιδιώξαμε να διαλευκάνουμε τον ρόλο της myospryn στην καρδιά και τη βιολογική σημασία της αλληλεπίδρασης myospryn-δεσμίνης. Για την επίτευξη αυτού του σκοπού χρησιμοποιήσαμε τόσο in vitro, όσο και in vivo στρατηγικές. Mε in vitro προσεγγίσεις μελετήσαμε τη σημασία της αλληλεπίδρασης δεσμίνης-AKAP/myospryn στη ρύθμιση του PKA μονοπατιού. Χρησιμοποιήσαμε πρωτογενείς καλλιέργειες μυοκαρδιοκυττάρων και δείξαμε ότι η έλλειψη της δεσμίνης επηρεάζει τουλάχιστον τον ρυθμό σύσπασης, την ανακύκλωση του β2 αδρενεργικού υποδοχέα και τη συσσώρευση του cΑΜΡ, υποδηλώνοντας έναν πιθανό ρόλο της δεσμίνης και της αλληλεπίδρασης δεσμίνης-AKAP/myospryn στην ορθή σύζευξη β-AR/αδενυλικής κυκλάσης και στην απευαισθητοποίηση του υποδοχέα που θα μπορούσαν να συμβάλουν στην ανάπτυξη της καρδιακής ανεπάρκειας λόγω έλλειψης της δεσμίνης. Mε in vivo προσεγγίσεις, διασαφηνίσαμε περαιτέρω το ρόλο της myospryn στην καρδιά και τη βιολογική σημασία της αλληλεπίδρασης myospryn-δεσμίνης. Αδρανοποιήσαμε τη myospryn στα ποντίκια μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα (ESC) και η επιτυχία του ομόλογου ανασυνδυασμού ήταν μόλις 0,9%. Η μελέτη μας είναι η πρώτη παγκόσμια περιγραφή της δημιουργίας του myospryn knockout μοντέλου ποντικιού, αποδεικνύοντας ότι, η απουσία της myospryn δεν προκαλεί εμβρυϊκή θνησιμότητα στα ποντίκια. Η έλλειψη της myospryn προκαλεί διατατική μυοκαρδιοπάθεια, η οποία χαρακτηρίζεται από λέπτυνση των τοιχωμάτων και διάταση του ιστού, ανωμαλίες στους θαλάμους της καρδιάς (αμφικολπική διάταση), ίνωση και διαταραχή της καρδιακής λειτουργίας. Η ανάλυση της υπερδομής ανέδειξε ότι η οργάνωση των σαρκομεριδίων δεν επηρεάζεται εμφανώς, με τα μυοϊνίδια να είναι καλά πακεταρισμένα και οργανωμένα, ωστόσο, η ακεραιότητα των εμβόλιμων δίσκων (ID) είναι αλλοιωμένη. Το πιο σημαντικό εύρημα της παρούσας μελέτης είναι οι σοβαρές ανωμαλίες στην υπερδομή των μιτοχονδρίων στον καρδιακό και σκελετικό μυ των myosp-/- ποντικιών, με περίεργα ενδομιτροχονδριακά έγκλειστα κυστίδια και εκτεταμένο εκφυλισμός των πτυχώσεων που συχνά συνοδευόταν από διόγκωση του σαρκοπλασματικού δικτύου (ΣΔ) και των Τ-σωληνίσκων, χωρίς να αποκλείεται η ανώμαλη μιτοφαγία. Συνολικά, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν έναν πιθανό ρόλο της myospryn μαζί με τη δεσμίνη στη φυσική και λειτουργική σύνδεση του ΣΔ δικτύου και των μιτοχονδρίων μέσω των MAMs (mitochondrial-associated ER membranes).