Διερεύνηση των ρεολογικών ιδιοτήτων αρθρικού υγρού από φυσιολογικούς ίππους και ίππους με οστεοαρθρίτιδα καθώς και ο χαρακτηρισμός των ιδιοτήτων νέων βιοϋλικών για την αντιμετώπισή της

Abstract

Degenerative joint disease or osteoarthritis is one of the most common pathological manifestations in equine industry, characterized by gradual degradation of the articular cartilage, lameness and loss of performance. Synovial joints are anatomical structures with complex mechanical properties, the connective tissue of which is essential for their proper functioning. Synovial fluid plays a primary mechanical and biological role in lubrication and protection of the avascular articular cartilage and normal joint function. Hyaluronic acid, a non-sulfated glucosaminoglycan structured by repeating molecules of D-glucuronic acid and N-acetylglucosamine, is considered a major component of normal synovial fluid. Although the exact mechanism of its action remains unknown, there are many studies to suggest that intra-articular injection of exogenous hyaluronic acid protects the articular cartilage, preventing its contact with catabolic enzymes and restoring the autogenous hyaluronic acid in cases of inflammation. Moreover, it is indicated that hyaluronic acid plays an important role in the viscoelastic properties of synovial fluid, presenting viscous behaviour at low shear rates and elastic behaviour at higher shear rates. Over the last decade, there has been considerable interest in the role of hyaluronic acid as a key component in the formation of viscoelastic properties of synovial fluid. It has been reported that the concentration of hyaluronic acid in osteoarthritic synovial fluid obtained from humans and horses was significantly reduced compared to the one obtained from normal joints.It is hypothesized that in a diseased joint, damage to articular cartilage can modify the rheological properties of synovial fluid. Degradation of hyaluronic acid molecules leads to diminished viscoelasticity of synovial fluid and compromises joint lubrication.The aim of the present thesis was to decipher the biological and biomechanical behavior of equine synovial fluid, to evaluate the concentration of hyaluronic acid in normal and pathological joints, as well as to detect the possible alterations in rheological properties, in order to characterize an ideal biomaterial for the viscosupplementation of equine osteoarthritis. The experimental project of this dissertation was carried out at the Equine Unit, School of Veterinary Medicine, and the Department of Chemical Engineering of the Aristotle University of Thessaloniki. Moreover, laboratory analysis of synovial fluid was carried out at the Diagnostic Laboratory, School of Veterinary Medicine, Aristotle University of Thessaloniki. In total, 160 horses were used. The horses divided in two groups, lived in the same premises (riding clubs in northern Greece or Athens racetrack, Markopoulo, Attica). The objectives of the present study were to determine the concentration of hyaluronic acid and rheological properties of synovial fluid from normal horses and horses with osteoarthritis, respectively. Based on these results, a multivariate linear mixed effect model was used in a population of 105 horses in order to examine the simultaneous effect of many factors (sex, breed, age, joint type, joint status) on the rheological parameters of synovial fluid. In addition, an attempt was made to evaluate the effect of intra-articular administration of the most commonly used commercial formulations on the rheological properties of synovial fluid. At the same time, it was decided to investigate the possible differences in the concentration of acute phase proteins in blood serum and synovial fluid, following intra-articular administration of the same formulations. Finally, in the last chapter, the properties of an ideal biomaterial were presented, based on the data extracted from the experiments in normal horses.In this study, for the first time, an optimized protocol was developed for the analysis of the rheological properties of equine synovial fluid. It was concluded that equine synovial fluid exhibits shear thinning behaviour and low viscoelastic properties, compared to any other species, based on the present literature. Particularly, based on the results from the oscillatory time sweep test, equine synovial fluid exhibited low G' and G'' values, progressively decreasing with time. Moreover, based on the oscillatory frequency sweep test data, it was concluded that at low frequencies equine synovial fluid adopts a viscous-like solution behaviour, while it exhibits its elastic behaviour at higher frequencies.In addition, the statistical analysis detected significant differences in the rheological properties of synovial fluid between the three different joint types (intercarpal, metacarpophalangeal and 2nd interphalangeal joint). The viscoelastic properties were higher in synovial fluid obtained from the intercapal and metacarpophalangeal joint compared to the values obtained from the 2nd interphalangeal joint. Additionally, an interbreed variation was also observed. The metacarpophalangeal joint exhibited significantly lower viscoelastic properties in the Thoroughbred group compared to Warmblood group.In addition, a strong negative correlation was observed between hyaluronic acid concentrations and lameness grade, and between hyaluronic acid concentrations and osteoarthritis. In particular, horses with osteoarthritis presented statistically significantly lower hyaluronic acid concentrations compared to normal horses.Regarding multivariate analysis used, examining the simultaneous effects of various factors (breed, age, sex, joint type, joint status) on the rheological properties of synovial fluid, the results are the following: a) a negative effect of age on the viscoelastic properties was observed, and b) the geldings presented significantly lower G'' values compared to mares.In addition, after repeated plain arthrocentecis no change was observed in the viscoelasticity of synovial fluid. It is also worth noting that no change was detected in rheological properties of synovial fluid, after intra-articular administration of hyaluronic acid formulations during the first 30 days post-injection. Consequently, the effectiveness of hyaluronic acid formulations in viscosupplementation is warranted.Finally acute phase proteins such as amyloid A, paraoxonase and haptoglobin proved to be inappropriate biomarkers to detect possible local and systemic responses to oxidative stress, following the intra-articular administration of betamethasone and hyaluronic acid in horses with chronic osteoarthritis.

Η εκφυλιστική αρθροπάθεια ή οστεοαρθρίτιδα, αποτελεί μια από τις συχνότερες παθολογικές καταστάσεις σε ίππους αθλητικής ιππασίας ή δρόμωνες ίππους, η οποία χαρακτηρίζεται από σταδιακή καταστροφή του αρθρικού χόνδρου, χωλότητα και σημαντική μείωση των αποδόσεων. Οι διαρθρώσεις αποτελούν ανατομικές δομές με σύνθετες μηχανικές ιδιότητες, ο συνδετικός ιστών των οποίων είναι απαραίτητος για την ορθή λειτουργία τους.Το αρθρικό υγρό παίζει πρωτεύοντα μηχανικό και βιολογικό ρόλο στη λειτουργία της άρθρωσης, τόσο μέσω της θρέψης του ανάγγειου αρθρικού χόνδρου (μεταφορά θρεπτικών συστατικών και προϊόντων μεταβολισμού) όσο και μέσω της λίπανσης της άρθρωσης και προστασίας της κατά την εφαρμογή δυνάμεων. Μερικά από τα κύρια συστατικά του αρθρικού υγρού, το οποίο παράγεται από κύτταρα του αρθρικού υμένα, είναι το υαλουρονικό οξύ, ενώ σε μικρές ποσότητες απαντώνται και άλλα μακρομόρια. Το υαλουρονικό οξύ, μια μη θειούχα γλυκοζαμινογλυκάνη που δομείται από επαναλαμβανόμενα μόρια D-γλυκουρονικού οξέος και Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης, αποτελεί αναπόσπαστο στοιχείο του αρθρικού υγρού σε φυσιολογικές διαρθρώσεις. Παρόλο που ο ακριβής μηχανισμός δράσης παραμένει άγνωστος, μελέτες υποδεικνύουν πως η χορήγηση εξωγενούς υαλουρονικού οξέος προστατεύει τον αρθρικό χόνδρο, αφενός αποτρέποντας την επαφή του με καταβολικά ένζυμα και αφετέρου αποκαθιστώντας την αυτογενή σύνθεση υαλουρονικού οξέος, η οποία διαταράσσεται σε περιπτώσεις φλεγμονής μέσω αποπολυμερισμού του. Το υαλουρονικό οξύ συμμετέχει σε μεγάλο βαθμό, στη διαμόρφωση των ιξωδοελαστικών ιδιοτήτων του αρθρικού υγρού, υιοθετώντας συμπεριφορά παχύρρευστου διαλύματος σε χαμηλούς ρυθμούς διάτμησης και ελαστικού σώματος σε υψηλότερους ρυθμούς διάτμησης.Την τελευταία δεκαετία υπάρχει έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον όσον αφορά στον ρόλο του υαλουρονικού οξέος, ως βασικό συστατικό, στην διαμόρφωση των ιξωδοελαστικών ιδιοτήτων του αρθρικού υγρού. Σε πλήθος μελετών έχει αναφερθεί πως η συγκέντρωση του υαλουρονικού οξέος του αρθρικού υγρού σε δείγματα από παθολογικές αρθρώσεις ανθρώπων και ίππων με αρθρίτιδα ήταν μειωμένη σε σχέση με αυτή σε φυσιολογικές αρθρώσεις. Σε μια πάσχουσα άρθρωση, η βλάβη στον αρθρικό χόνδρο είναι δυνατό να τροποποιήσει τις ρεολογικές ιδιότητες του αρθρικού υγρού, γεγονός το οποίο αποδίδεται στον αποπολυμερισμό μορίων υαλουρονικού οξέος με υψηλό μοριακό βάρος καθώς και της συνολικής συγκέντρωσης αυτού. Η αποδόμηση του υαλουρονικού οξέος οδηγεί στη μείωση της ιξωδοελαστικής ικανότητας του αρθρικού υγρού και συνεπώς στη μη σωστή λίπανση της άρθρωσης.Η παρούσα μελέτη επικεντρώθηκε στον χαρακτηρισμό της βιολογικής και βιοκινητικής συμπεριφοράς του αρθρικού υγρού του ίππου και στην καταγραφή της συγκέντρωσης του υαλουρονικού οξέος, καθώς και των πιθανών αλλαγών των ρεολογικών ιδιοτήτων μεταξύ φυσιολογικών και παθολογικών αρθρώσεων με στόχο την παρουσίαση των ιδιοτήτων ενός ιδανικού βιοϋλικού για την αντιμετώπιση της οστεοαρθρίτιδας του ίππου. Το πειραματικό σκέλος της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε στη Μονάδα Ιπποειδών της Κλινικής Ζώων Συντροφιάς Α.Π.Θ., καθώς και στο Τμήμα Χημικών Μηχανικών Α.Π.Θ. Επίσης, η μικροσκοπική ανάλυση του αρθρικού υγρού έγινε στο Διαγνωστικό Εργαστήριο του Τομέα Κλινικών Α.Π.Θ. Συνολικά, στη διατριβή αυτή χρησιμοποιήθηκαν 160 ίπποι οι οποίοι προσκομίστηκαν στη Μονάδα Ιπποειδών Α.Π.Θ., οι οποίοι διαβιούσαν σε ιππικούς ομίλους και ιδιωτικούς στάβλους της Βορείου Ελλάδας αλλά και δρόμωνες ίπποι του Ιππόδρομου Αττικής (Μαρκόπουλο Αττικής). Οι ίπποι αυτοί χωρίστηκαν κατάλληλα σε υποομάδες ώστε να απαντηθούν τα ερευνητικά ερωτήματα της διατριβής. Ειδικότερα, στόχοι της διατριβής ήταν ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης υαλουρονικού οξέος και των ρεολογικών ιδιοτήτων του αρθρικού υγρού από φυσιολογικούς ίππους και από ίππους με οστεοαρθρίτιδα, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, τα αποτελέσματα που προέκυψαν χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία ενός πολυμεταβλητού μοντέλου μικτών επιδράσεων (multivariate linear mixed effect model) σε πληθυσμό 105 ίππων προκειμένου να εξεταστεί η ταυτόχρονη επίδραση πολλών παραγόντων (φύλο, φυλή, ηλικία, τύπος άρθρωσης, κατάσταση άρθρωσης) στις ρεολογικές παραμέτρους του αρθρικού υγρού. Επιπλέον, με γνώμονα τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τους προηγούμενους πειραματισμούς έγινε μια προσπάθεια εκτίμησης της επίδρασης των πιο συχνών ενδοαρθρικά χορηγούμενων εμπορικών σκευασμάτων στις ρεολογικές ιδιότητες του αρθρικού υγρού. Παράλληλα, κρίθηκε σκόπιμο να διερευνηθούν οι μεταβολές στη συγκέντρωση συγκεκριμένων πρωτεϊνών οξείας φάσης στον ορό του αίματος και στο αρθρικό υγρό ίππων έπειτα από ενδοαρθρική χορήγηση των πιο συχνών ενδοαρθρικά χορηγούμενων εμπορικών σκευασμάτων. Τέλος, στο τελευταίο κεφάλαιο, αναλύθηκαν οι ιδιότητες, από εμβιομηχανική σκοπιά, του ιδανικού βιοϋλικού για ενδοαρθρική χορήγηση, για την ιξωδοαναπλήρωση στον έλεγχο της οστεοαρθρίτιδας.Τα δεδομένα της διατριβής αυτής οδήγησαν στη δημιουργία και ανάπτυξη ενός βελτιστοποιημένου πρωτοκόλλου για την επεξεργασία του αρθρικού υγρού του ίππου. Διαπιστώθηκε ότι το αρθρικό υγρό του ίππου παρουσιάζει συμπεριφορά διατμητικής λέπτυνσης και εξαιρετικά χαμηλές ιξωδοελαστικές ιδιότητες, σε σύγκριση με οποιοδήποτε άλλο είδος, με βάση την παρούσα βιβλιογραφία. Συγκεκριμένα, με βάση τα αποτελέσματα από τις δοκιμές σάρωσης με ταλάντωση σε μεταβαλλόμενο χρόνο (oscillatory time sweep test) το αρθρικό υγρό του ίππου παρουσίασε χαμηλές τιμές του μέτρου αποθήκευσης ή ελαστικότητας (G') και του μέτρου απώλειας ή ιξώδους (G''), προοδευτικά μειούμενες με το χρόνο. Επιπλέον, με βάση τις δοκιμές σάρωσης συχνότητας ταλάντωσης (oscillatory frequency sweep test) διαπιστώθηκε ότι σε χαμηλές συχνότητες το αρθρικό υγρό του ίππου υιοθετεί συμπεριφορά ρευστού, ενώσε υψηλές συχνότητες κυριαρχεί η ελαστική του συμπεριφορά.Επιπλέον, με βάση τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης, διαπιστώθηκαν σημαντικές διαφορές στις ρεολογικές ιδιότητες του αρθρικού υγρού μεταξύ των τριών διαφορετικών τύπων αρθρώσεων που μελετήθηκαν (μεσοκαρπική, μετακαρπιοφαλαγγική και 2η μεσοφαλαγγική). Συγκεκριμένα οι τιμές των μέτρων G'και G" ήταν υψηλότερες στο αρθρικό υγρό της μεσοκαρπικής και της μετακαρπιοφαλαγγικής άρθρωσης σε σύγκριση με τις τιμές του αρθρικού υγρού από τη 2η μεσοφαλαγγική άρθρωση της φυλής Warmblood. Επιπρόσθετα, διαπιστώθηκαν διαφορές στις τιμές των μέτρων G' και G" και μεταξύ των υπό μελέτη φυλών. Συγκεκριμένα, η μετακαρπιοφαλαγγική άρθρωση φάνηκε πως παρουσιάζει σημαντικά χαμηλότερες ιξωδοελαστικές ιδιότητες στη φυλή Thoroughbred σε σχέση με τη φυλή Warmblood.Επιπλέον, παρατηρήθηκε ισχυρή αρνητική συσχέτιση μεταξύ των συγκεντρώσεων υαλουρονικού οξέος (HA) και του βαθμού χωλότητας καθώς και του βαθμού οστεοαρθρίτιδας με βάση την ακτινολογική εικόνα στα δείγματα παθολογικού αρθρικού υγρού. Συγκεκριμένα, οι ίπποι με οστεοαρθρίτιδα παρουσίασαν στατιστικώς σημαντικά χαμηλότερες συγκεντρώσεις HA σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ίππους στο σύνολο των δειγμάτων αρθρικού υγρού που εξετάστηκαν.Σχετικά με τη διαδικασία αξιολόγησης της ταυτόχρονης επίδρασης διαφόρων παραγόντων (φυλή, ηλικία, φύλο, τύπος άρθρωσης) στις ρεολογικές ιδιότητες του αρθρικού υγρού, παρατηρήθηκε α) αρνητική επίδραση της ηλικίας στις τιμές των μέτρων G' και G'', και β) πως οι εκτομίες της μελέτης αυτής παρουσίασαν σημαντικά χαμηλότερες τιμές του μέτρου G" σε σύγκριση με τις φοράδες. Σημαντικό εύρημα αποτελεί το γεγονός πως η απλή αρθροκέντηση δεν παρουσιάζει καμία αλλαγή στην ιξωδοελαστικότητα του αρθρικού υγρού. Επίσης, αξίζει να αναφερθεί ότι δεν παρατηρήθηκε καμία αλλαγή στις ιξωδοελαστικές ιδιότητες του αρθρικού υγρού μετά την ενδοαρθρική χορήγηση υαλουρονικού οξέος τις πρώτες 30 ημέρες. Κατά συνέπεια, προκύπτει ότι οι παρούσες μέθοδοι ιξωδοαναπλήρωσης φαίνεται να μην έχουν θετική επίδραση στις ρεολογικές ιδιότητες του αρθρικού υγρού.Τέλος, σε σχέση με τον προσδιορισμό των πρωτεϊνών οξείας, το αμυλοειδές A, η παραοξονάση και η απτοσφαιρίνη αποδείχθηκαν ακατάλληλοι δείκτες για την ανίχνευση πιθανών τοπικών και συστημικών αποκρίσεων στο οξειδωτικό στρες, μετά τη χορήγηση βηταμεθαζόνης και υαλουρονικού οξέος σε ίππους με χρόνια οστεοαρθρίτιδα.