Ανάπτυξη μεθοδολογίας προσδιορισμού φυτοφαρμάκων με οπτικό συμβολομετρικό ανοσοαισθητήρα ολοκληρωμένο σε ψηφίδες πυριτίου

Abstract

The widespread usage of pesticides in modern agricultural practice is due to their beneficial effects in controlling pests and plant disease vectors. Nevertheless, many substances have been found to exhibit toxic effects both on animals and humans and for that reason European Union under the framework of sustainable use of pesticides has established maximum residue levels (MRL) for pesticides in water as well as in food and animal feed. The MRL for each pesticide in water is 0.1 ng/mL while for the sum of all substances is 0.5 ng/mL. The purpose of this thesis was to develop an optical label-free immunosensor for the real-time and simultaneous determination of two banned herbicides, namely paraquat and atrazine as well as for the fast and sensitive determination of glyphosate all in drinking water. The immunosensor was based in the White Light Reflectance Spectroscopy and allows for real-time and label-free monitoring of immunoreactions by monitoring the shift in the interference spectrum created upon reflection of white light on a Si/SiO2 surface, functionalized with recognition biomolecules, in the course of the binding reaction. In order to accomplish this goal, enzyme immunoassays were firstly developed and optimized for each analyte separately and then the respective methods were developed and optimized in the immunosensor for each analyte separately. The simultaneous determination of the two banned pesticides was fast (12 min), without any sample pretreatment prior to the analysis and with Limits of Detection 50 pg/mL and 40 pg/mL for atrazine and paraquat, respectively. Concerning the determination of glyphosate, it was completed within 25 min with LOD 10 pg/mL, which is 10 times lower than the corresponding MRL in drinking water. The immunosensor’s ability for determination of targeted analytes in real samples was evaluated by analyzing fortified drinking and tap water samples. It was found that the results received with the immunosensor were in good agreement with those obtained by the respective ELISA methods. Taking into consideration the low cost of the optical setup and the small and portable instrumentation, we expect that the developed immunosensor can find wide application in the on-site detection of pesticides.

Η χρήση φυτοφαρμάκων είναι εξαιρετικά διαδεδομένη στη σύγχρονη γεωργική πρακτική. Παρά ταύτα πολλά φυτοφάρμακα είναι ενώσεις με τοξική δράση τόσο για τα ζώα όσο και για τον άνθρωπο και για αυτό τον λόγο πολλά εξ’ αυτών έχουν απαγορευτεί εντός της Ευρωπαϊκής Ένωσης. Για το λόγο αυτό η Ευρωπαϊκή Ένωση έχει θεσπίσει σαφή όρια υπολειμμάτων φυτοφαρμάκων τόσο στο νερό όσο και στα τρόφιμα. Το ανώτατο όριο καταλοίπου (Maximum Residue Level, MRL) για έκαστη ουσία στο νερό είναι 0.1 ng/mL, ενώ για το σύνολο των ουσιών είναι 0.5 ng/mL. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ανάπτυξη μεθόδου για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό δύο απαγορευμένων φυτοφαρμάκων του paraquat και του atrazine καθώς και μεμονωμένα του glyphosate, το οποίο είναι ένα από τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα φυτοφάρμακα, σε δείγματα πόσιμου νερού χρησιμοποιώντας οπτικό ανοσοαισθητήρα ο οποίος βασίζεται στη φασματοσκοπία ανάκλασης λευκού φωτός (White Light Reflectance Spectroscopy, WLRS). Ο αισθητήρας επιτρέπει την καταγραφή του αναλυτικού σήματος σε πραγματικό χρόνο, χωρίς τη χρήση ιχνηθετών, παρακολουθώντας τη μετατόπιση του φάσματος συμβολής που δημιουργείται κατά την ανάκλαση λευκού φωτός από επιφάνεια Si/SiO2 πάνω στην οποία πραγματοποιείται η εκάστοτε ανοσοαντίδραση. Για την επίτευξη αυτού του σκοπού αναπτύχθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν ενζυμοανοσοχημικοί προσδιορισμοί (ELISA) για κάθε αναλύτη καθώς και μέθοδοι ανίχνευσης μεμονωμένων αναλυτών με τον αισθητήρα. Η μέθοδος του ταυτόχρονου προσδιορισμού των δύο απαγορευμένων φυτοφαρμάκων ήταν ταχεία (12 min), δεν περιελάμβανε καμία κατεργασία του δείγματος προ της ανάλυσης και τα όρια ανίχνευσης αναλύτες ήταν 50 pg/mL και 40 pg/mL για το atrazine και το paraquat, αντίστοιχα. Όσον αφορά στη μέθοδο ανίχνευσης του glyphosate αυτή πραγματοποιήθηκε εντός 25 λεπτών με όριο ανίχνευσης (10 pg/mL) δέκα φορές χαμηλότερο από το MRL. Ο αισθητήρας αξιολογήθηκε με την ανάλυση εμβολιασμένων δειγμάτων πόσιμου νερού και νερού βρύσης και διαπιστώθηκε ότι οι τιμές που ελήφθησαν ήταν σε καλή συμφωνία με αυτές που ελήφθησαν από τις μεθόδους ELISA που αναπτύχθηκαν. Η χαμηλού κόστους και φορητή οπτική διάταξη παράλληλα με το μικρό μέγεθος καθιστούν το προτεινόμενο σύστημα κατάλληλο για επιτόπιες αναλύσεις φυτοφαρμάκων.