Τυποποίηση στελεχών Legionella Pneumophila από περιβαλλοντικά δείγματα και συρροές κρουσμάτων με Matrix assisted laser desortion ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (ΜALDI-TΟF MS)

Abstract

Presently, Legionella risk assessment focuses on detection of the microorganism in water samples. Since human disease is caused mostly by Legionella pneumophila serogroup 1 (Lp1) and has been associated with the presence of pathogenicity locus lvh and rtxA, it is important to assess not only Legionella serogroup but the aforementioned virulence factors also in order to perform complete risk assessment.Aim: (i) Establish and validate a simple, rapid and robust MALDI-TOF MS-based method for the assignment of Lp isolates to serogroup 1 or 2-15. (ii) Identification of peak biomarkers in order to detect the presence of locus lvh and rtxA to the isolated strains during environmental investigations.Method: Fifteen (15) reference strains and 150 Lp environmental isolates (80 Lp2-15 and 70 Lp1 strains) were used. Eight (8) Lp2-15 strains, were serotyped using monoclonal antibodies (Mab), while the remaining environmental isolates were serotyped using latex agglutination test. All the strains were PCR-tested for the presence of lvh and rtxA locus. Independent training and validation strain sets were constituted; all the strains were protein-extracted and submitted to MALDI-TOF MS analysis. The obtained raw spectra were introduced into the Mass-Up software platform for biomarker detection both for serogroup assignment and pathogenicity locus detection. Validation of the assigned biomarkers followed using the validation set strains.Results: For serogroup assignment, the Mass-up analysis indicated five potential discriminating peaks and classified correctly 115 out of 132 validation set strains displaying sensitivity of 87.5% (95%CI:77.59-94.12%),specificity of 86.67% (95%CI:75.41-94.06%) and 87.12% accuracy (95%CI:80.18-92.32%). Concerning the pathogenicity locus detection, the Mass-up analysis indicated two ion peaks for rtxA locus discrimination and one peak for lvh locus discrimination. Concerning the lvh virulence gene, the algorithm classified correctly 113 out of 137 positive and all negative strains-14 in total-showing sensitivity 82.48% (95%CI:75.06-88.44%), specificity 100.00% (95%CI:76.84-100.00%) and 84.11% accuracy (95%CI:77.28-89.54%). For rtxA locus, 134 out of 134 positive and 14 out of 17 negative strains were correctly classified with sensitivity 100.00% (95%CI:97.28-100.00%), specificity 76.47% (95%CI:50.10-93.19%) and accuracy 97.35% (95%CI:93.36-99.27%). Conclusion: MALDI-TOF MS, using the protein extraction protocol, displayed good performance for Lp serogroup assignment and detection of the lvh and rtxA virulence genes. Standardization and evaluation of the method using the direct plating technique, in order to simplify the protocol, could contribute to the rapid, inexpensive and easy risk assessment and investigation for LD cases.

Η εκτίμηση κινδύνου και η πρόληψη της Νόσου των Λεγεωναρίων βασίζονται κυρίως στην ανίχνευση του μικροοργανισμού σε δείγματα νερού. Νόσο στον άνθρωπο προκαλεί κυρίως η Legionella pneumophila οροτύπου 1 (Lp1) και ιδιαίτερα στελέχη τα οποία φέρουν τις περιοχές παθογονικότητας lvh και rtxA. Επομένως, η αξιολόγηση τόσο του ορότυπου όσο και των προαναφερθέντων παραγόντων παθογονικότητας είναι εξαιρετικά σημαντική προκειμένου να υπάρχει ολοκληρωμένη εκτίμηση κινδύνου ενός συστήματος νερού. Σκοπός της διατριβής: 1. Η ανάπτυξη μίας απλής, ταχείας, φθηνής και αξιόπιστης μεθοδολογίας για τον προσδιορισμό των οροτύπων στελεχών Lp, η οποία να μπορεί να εφαρμοστεί ως μέθοδος ρουτίνας σε ένα μικροβιολογικό εργαστήριο.2. Ο προσδιορισμός αξιόπιστων βιοδεικτών με σκοπό την ανίχνευση των περιοχών παθογονικότητας lvh και rtxA σε στελέχη τα οποία απομονώνονται κατά τη διάρκεια τακτικών ελέγχων. 3. Η επικύρωση των ανωτέρω μεθόδων. Υλικά και μέθοδοι: Για τη διατριβή χρησιμοποιήθηκαν 15 στελέχη αναφοράς και 150 περιβαλλοντικά στελέχη Lp (70 Lp1 και 80 Lp2-15 στελέχη). Οκτώ (8) Lp2-15 στελέχη οροτυπήθηκαν με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων (monoclonal antibodies-Mab), ενώ τα υπόλοιπα περιβαλλοντικά στελέχη οροτυπήθηκαν με τη χρήση δοκιμασίας ανοσοσυγκόλησης. Σε όλα τα στελέχη πραγματοποιήθηκε PCR προς ανίχνευση των περιοχών lvh και rtxA. Κατόπιν, δημιουργήθηκαν ομάδες στελεχών αναφοράς και στελεχών επικύρωσης. Όλα τα στελέχη υποβλήθηκαν σε εξαγωγή των ριβοσωμικών και επιφανειακών πρωτεϊνών και ακολούθησε ανάλυση με MALDI-TOF MS. Στα πρωτογενή φάσματα των στελεχών των ομάδων αναφοράς έγινε επεξεργασία με το λογισμικό Mass-Up για την ανάδειξη βιοδεικτών τόσο για τον προσδιορισμό του οροτύπου όσο και για την ανίχνευση των περιοχών παθογονικότητας. Ακολούθησε επικύρωση της μεθόδου με τη χρήση των στελεχών των ομάδων επικύρωσης.Αποτελέσματα: Για τον προσδιορισμό του οροτύπου η ανάλυση με το λογισμικό Mass-up υπέδειξε πέντε (5) πρωτεϊνικές κορυφές ως πιθανούς βιοδείκτες για τον ορότυπο. Ο αλγόριθμος ταξινόμησε ορθά 115 από τα 132 στελέχη της ομάδας επικύρωσης με ακρίβεια 87,12% (95%CI:80,18-92,32%). Η ευαισθησία της μεθόδου προσδιορίστηκε στο 87,5% (95%CI:77.59-94.12%) και η ειδικότητα στο 86,67% (95%CI:75,41-94,06%). Σχετικά με την ανίχνευση των περιοχών παθογονικότητας προσδιορίστηκαν δύο πρωτεϊνικές κορυφές που μπορούν να χρησιμεύσουν ως βιοδείκτες για την rtxA περιοχή και μία για την lvh. Σε ό,τι αφορά την ανίχνευση της lvh περιοχής, με τη χρήση των βιοδεικτών, ταξινομήθηκαν ορθά τα 113 από τα 137 θετικά και όλα τα αρνητικά στελέχη (14 συνολικά). Η μέθοδος επέδειξε ευαισθησία 82,48% (95%CI:75,06-88,44%), ειδικότητα 100,00% (95%CI:76,84-100,00%) και ακρίβεια 84,11% (95%CI:77,28-89,54%). Ομοίως, για την rtxA περιοχή, 134 από τα 134 θετικά στελέχη και 14 από τα 17 αρνητικά στελέχη ταξινομήθηκαν ορθά. Η μέθοδος παρουσίασε ευαισθησία 100,00% (95%CI:97,28-100,00%), ειδικότητα 76,47% (95%CI:50,10-93,19%) και ακρίβεια 97,35% (95%CI:93,36-99,27%). Συμπεράσματα: Η μέθοδος MALDI-TOF MS, με τη χρήση του πρωτοκόλλου της πρωτεϊνικής εξαγωγής, αποδείχθηκε αξιόπιστη τόσο στον προσδιορισμό του οροτύπου της Lp όσο και στην ανίχνευση των περιοχών παθογονικότητας lvh και rtxA. Αυτοματοποίηση της μεθόδου και περαιτέρω αξιολόγηση με τη χρήση της τεχνικής της απευθείας επίστρωσης του μικροοργανισμού, ώστε να απλοποιηθεί ακόμη περισσότερο το πρωτόκολλο, θα μπορούσε να συνεισφέρει σε μεγαλύτερο βαθμό στην ταχεία, φθηνή και απλή αξιολόγηση κινδύνου, καθώς και στη διερεύνηση κρουσμάτων της Νόσου των Λεγεωναρίων.