Ο ρόλος της Tip60 στη μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων κυτταροκινών των Τ βοηθητικών λεμφοκυττάρων

Abstract

IL-2 is the first cytokine produced when naive T helper (Th) cells are activated and differentiate into proliferating pre-Th0 precursors. Transcriptional regulation of IL-2 gene expression requires a relatively small segment of DNA, about 300bp, localized immediately upstream from the transcriptional start site integrating the action of different transcriptional regulators. IL-2 repression occurs through the distal antigen receptor response element (ARRE)-2 (-292 to -273), which is also an NFAT binding site in activated Th cells. A search in public gene expression databases for DNA-binding proteins which could contribute to IL-2 regulation revealed that the ets-2 oncogene and the MYST acetyltransferase family were strong candidates. Our recent publication has shown that the IL-2 gene is actively repressed in primary naive Th cells by the transcription factor Ets-2, which binds to the ARRE-2 element of the proximal IL-2 promoter. Ets-2 does not bind to ARRE-2 in activated or memory Th cells. The ARRE-2 sequence of the IL-2 promoter is similar to the area of HIV-1-LTR that extends from -279 to-250 (RATS sequence), participating in regulation of expression of both IL-2 gene and HIV-1 through common transcription factors. As we have recently shown, transcription factor Ets-2 exerts an inhibitory effect in HIV-1 expression through its binding on LTR RATS sequence. In parallel, Tip60 participates in the transcriptional regulation of HIV-1 as it was isolated as interacting protein with the Tat protein of the virus. Members of the MYST family, including Tip60, act as histone acetyltransferases, suggesting potential roles in chromatin remodeling and gene regulation. The ability of Tip60 to acetylate histones indicates it as an attractive molecule for the transcriptional regulation of IL-2 gene.The combination of the above observations has prompted us to study the role of Tip60 protein in the transcriptional regulation of IL-2 gene. Particularly, our aim was to elucidate the molecular mechanisms involved in the transcriptional regulation of the IL-2 gene through Tip60 and its possible interactions with key factors such as NFAT2 and Ets-2.The results of the current study suggest that Tip60 induces the IL-2 transcriptional activity. In particular, Tip60 overexpression and silencing resulted in the activation and suppression of the IL-2 gene, respectively in Jurkat cells. To determine whether Tip60 itself causes IL-2 induction or potentially acting through a complex, interactions between Tip60, NFAT2 and Ets-2 were assessed. The results demonstrated an interaction between NFAT2 and Tip60 upon cell activation. Tip60 and Ets-2 interaction was observed in resting and activated cells whereas no interaction was detected between NFAT2 and Ets-2 in any condition. Following this we assayed the recruitment of Tip60 and Ets-2 on key regions of IL-2 promoter. The results showed that in unstimulated cells, both Tip60 and Ets-2 were recruited to the ARRE-2 promoter element. In contrast, cell stimulation resulted in the departure of Tip60 and Ets-2 from the ARRE-2 element and binding of NFAT2 to this element. In parallel, Tip60 and Ets-2 were recruited to the ARRE-1 / TATA box element, a result consistent with the concomitant activation of IL-2.Summarizing, the results of this study show that Tip60 acts as a co-activator of IL-2 transcription. Tip60 and Ets-2 act through a common complex. Upon cell stimulation NFAT2 is bound to the same complex. Tip60 and Ets-2 recruitment to the ARRE-2 element (in resting conditions) where IL-2 expression is blocked and their repositioning to the ARRE-1 element (in activated cells) which coincides with the transcriptional IL-2 induction, highlights the importance of Tip60 in this process. Malfunction of such a mechanism at the molecular level could lead to the disturbance of later events in Th cell plasticity, leading in turn to autoimmune diseases. Elevated levels of IL-2 have been found in the serum of patients who are in the active phase of Multiple Sclerosis (MS) disease. Our recent study has shown significantly reduced mRNA and protein synthesis of Ets-2 in naive Th cells isolated from patients with remitting-relapsing MS and lack of Ets-2 binding to the ARRE-2 element of the IL-2 promoter. Thus, in the present study we examined the expression of Tip60 in isolated Th populations derived from MS patients compared to healthy controls. The results showed increased Tip60 mRNA expression in Th cell subpopulations including naïve and memory Th cells versus healthy controls. Elevated Tip60 expression coincided with increased expression of IL-2. The NFAT2 mRNA exhibited similar levels in both naïve and memory Th cells in healthy controls versus MS patients. Concluding we suggest that the increased IL-2 levels in MS patients is likely due to the presence of a "defect" in the suppressive mechanism of IL-2. This probably occurs due to the reduced synthesis and binding of Ets-2 to the ARRE-2 element. At the same time, elevated levels of IL-2 in the memory Th cells may be due to the increased levels of Tip60 which seems to exert its inductive effect in pathological conditions as well.

H ιντερλευκίνη-2 (IL-2) είναι η πρώτη κυτταροκίνη που εκφράζεται στα παρθενικά Τ βοηθητικά (Τh) λεμφοκύτταρα όταν αυτά ενεργοποιηθούν και είναι απαραίτητη για τη διαφοροποίηση των παρθενικών Th κυττάρων σε επαγώγιμα Τh0 κύτταρα. Η μεταγραφή της IL-2 παραμένει ανενεργή προεπαγωγικά μέσω ρύθμισης που πραγματοποιείται σε μια μικρή περιοχή του υποκινητή της, που εκτείνεται από το -292 έως το -273bp. Η περιοχή αυτή ονομάζεται ARRE-2 και αποτελεί περιοχή πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα NFAT. Μια εκτεταμένη in silico ανάλυση μορίων στην περιοχή ARRE-2 του υποκινητή της IL-2 αποκάλυψε τουλάχιστον 25 διαφορετικούς παράγοντες που μπορούν να στρατολογούνται στην παραπάνω περιοχή, ανάμεσα στους οποίους ήταν ο παράγοντας Ets-2 και η οικογένεια των ακετυλοτρανσφερασών MYST. Σε πρόσφατη δημοσίευση του εργαστηρίου μας δείξαμε ότι ο Ets-2 δεσμεύεται στην περιοχή ARRE-2 και ενέχει δράση προεπαγωγικού καταστολέα καθώς υπερέκφρασή του και ταυτόχρονη πρόσδεσή του στην ARRE-2 DNA ακολουθία μειώνει την έκφραση της IL-2. Η δε έκφρασή του σε ενεργοποιημένα παρθενικά Τh κύτταρα μειώνεται, με παράλληλη αύξηση της έκφρασης της IL-2. Παράλληλα, πρόσφατη δημοσίευση του εργαστηρίου μας έδειξε ότι ο Εts-2 συμμετέχει στη καταστολή της μεταγραφής του HIV-1. Η ρύθμιση της έκφρασης της IL-2 και του HIV-1 στα ανθρώπινα παρθενικά Τh λεμφοκύτταρα είναι παρόμοια αφού σε ομόλογες περιοχές του LTR του ιού και του υποκινητή της IL-2 προσδένονται ένα ή περισσότερα κοινά μόρια. Από την άλλη έχει δειχτεί ότι η Tip60 συμμετέχει στην μεταγραφική ρύθμιση του HIV-1 καθώς απομονώθηκε σαν αλληλεπιδρώσα με την πρωτεΐνη Tat του ιού. Τα μέλη της οικογένειας MYST, μεταξύ αυτών και η Tip60, δρουν ως ακετυλοτρανσφεράσες ιστονών υποδηλώνοντας πιθανούς ρόλους στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης και στην γονιδιακή ρύθμιση. Η ικανότητα της Tip60 να ακετυλιώνει τις ιστόνες, κάνει ελκυστική την εμπλοκή της δομής της χρωματίνης στην υπό μελέτη διαδικασία της μεταγραφικής ρύθμισης του γονιδίου της IL-2. Ο συνδυασμός των παραπάνω παρατηρήσεων μας ώθησε να ασχοληθούμε με τη μελέτη του ρόλου της πρωτεΐνης Tip60 στην έκφραση γονιδίων των κυτταροκινών και ειδικότερα της IL-2. Συγκεκριμένα η παρούσα διατριβή στοχεύει στην διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου της IL-2 μέσω της Tip60 και πιθανών αλληλεπιδράσεών της με παράγοντες κλειδιά που συμμετέχουν στην ρύθμιση του γονιδίου, όπως τον παράγοντα NFAT2 και τον Ets-2.Τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής υποστηρίζουν ότι η Tip60 δρα επαγωγικά στην μεταγραφική ενεργότητα της IL-2. Συγκεκριμένα, η υπερέκφραση της Tip60 οδήγησε σε σταδιακή αύξηση της γονιδιακής έκφρασης της IL-2 στα ενεργοποιημένα κύτταρα Jurkat ενώ δεν είχε αντίκτυπο στα εν ηρεμία κύτταρα. Αντίστοιχα η αποσιώπηση της έκφρασης της Tip60, οδήγησε σε μείωση της έκφρασης της IL-2 παρουσία σημάτων ενεργοποίησης. Προκειμένου να διαπιστωθεί εάν ο επαγωγικός ρόλος της Tip60 προέρχεται αμιγώς από την ίδια ή ενδεχομένως η δράση της ασκείται μέσω ενός συμπλόκου, ελέγχθηκε η ύπαρξη αλληλεπίδρασης μεταξύ των Tip60 και άλλων σημαντικών μεταγραφικών παραγόντων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της IL-2 όπως του NFAT2 και του Εts-2. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπήρξε αλληλεπίδραση μεταξύ των NFAT2 και Tip60 μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων. Αλληλεπίδραση ανιχνεύθηκε επίσης και μεταξύ των Tip60 και Εts-2 τόσο όταν τα κύτταρα ήταν εν ηρεμία αλλά και μετά την ενεργοποίησή τους. Δεν ανιχνεύθηκε αλληλεπίδραση μεταξύ των NFAT2 και Εts-2 σε καμία συνθήκη. Εφόσον ανιχνεύσαμε τις αλληλεπιδράσεις της Tip60 με τον παράγοντα Ets-2 και με τον NFAT2, ελέγξαμε το εάν η ρύθμιση της μεταγραφής της IL-2 επηρεάζεται από την στρατολόγηση των Tip60 και Ets-2 στον υποκινητή του γονιδίου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η Tip60 και ο παράγοντας Ets-2 στρατολογούνται στην ARRE-2 αλληλουχία του υποκινητή της IL-2 σε συνθήκες ηρεμίας. Η ενεργοποίηση των κυττάρων οδήγησε σε μειωμένη ικανότητα δέσμευσης των Tip60 και Ets-2 στην ARRE-2 αλληλουχία και στη μεταφορά και στρατολόγηση των δυο αυτών πρωτεϊνών στην ARRE-1/TATA box αλληλουχία, περιοχή απαραίτητη για την ενεργοποίηση της IL-2. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας δείχνουν ότι η Tip60 δρα ως συνενεργοποιητής της μεταγραφής της IL-2. Παράλληλα, η Tip60 και ο παράγοντας Εts-2 φαίνεται να δρουν μέσω ενός κοινού συμπλόκου, στο οποίο προσαρτάται και ο παράγοντας NFAT2 μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων. Η στρατολόγηση των Tip60 και Εts-2 στην θέση ARRE-2 σε συνθήκες ηρεμίας όπου η IL-2 είναι σε καταστολή και η μετακίνηση των πρωτεϊνών αυτών στην περιοχή ARRE-1 μετά την ενεργοποίηση των κυττάρων, η οποία συμπίπτει με την επαγωγή της μεταγραφικής δραστηριότητας του γονιδίου, καταμαρτυρούν την σπουδαιότητα της Tip60 στη διαδικασία αυτή. Η συμμετοχή των Tip60 και Ets-2 στην μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου της IL-2 μας ώθησε να εξετάσουμε το εάν ενδεχόμενη απορρύθμιση του παραπάνω μηχανισμού σχετίζεται με την παθογένεια αυτοάνοσων νοσημάτων. Αυξημένα επίπεδα της IL-2 έχουν βρεθεί στον ορό ασθενών που βρίσκονται στην ενεργή φάση της νόσου της Σκλήρυνσης κατά Πλάκας (ΣΚΠ). Παράλληλα, πρόσφατη μελέτη του εργαστηρίου μας, έδειξε ότι η έκφραση του παράγοντα Εts-2 είναι μειωμένη στα παρθενικά Th λεμφοκύτταρα ασθενών που πάσχουν από το τύπου Th1 αυτοάνοσο νόσημα ΣΚΠ, ενώ βρέθηκε ανικανότητα πρόσδεσης του Εts-2 στην ARRE-2 αλληλουχία του υποκινητή της IL-2 στα κύτταρα αυτά. Έτσι, στην παρούσα μελέτη ελέγχθηκε η έκφραση της Tip60 σε απομονωμένους πληθυσμούς Τ λεμφοκυττάρων που απομονώθηκαν από ασθενείς με ΣΚΠ σε σύγκριση με υγιείς δότες. Τα αποτελέσματα έδειξαν αυξημένη γονιδιακή έκφραση της Tip60 στα κύτταρα των ασθενών η οποία συμπίπτει με την αυξημένη έκφραση της IL-2. Ο παράγοντας NFAT2 παρουσίασε παρόμοια επίπεδα έκφρασης τόσο στα παρθενικά όσο και στα μνημονικά Th κύτταρα μεταξύ υγιών και ΣΚΠ ασθενών. Συνεπώς συμπεραίνουμε ότι για την αύξηση των επιπέδων της IL-2 σε ασθενείς με ΣΚΠ πιθανόν να οφείλεται η παρουσία «βλάβης» στο κατασταλτικό μηχανισμό δράσης της έκφρασής της μέσω της μειωμένης σύνθεσης και πρόσδεσης στην αλληλουχία ARRE-2 του παράγοντα Ets-2. Παράλληλα, τα αυξημένα επίπεδα της ΙL-2 στα μνημονικά Th κύτταρα πιθανόν να οφείλονται στα αυξημένα επίπεδα της Tip60 η οποία φαίνεται να ασκεί την επαγωγική της δράση και σε παθολογικές καταστάσεις.