Παραγωγή τερπενοειδών από φωτοσυνθετικούς μικροοργανισμούς

Abstract

The main objective of this study was the heterologous production of the monoterpenoid β-phellandrene by Synechocystis transformants. The cyanobacterium Synechocystis is a model organism, in which the “photosynthesis to fuel” approach has been successfully applied. Thus, it is a suitable microorganism for biotechnological exploitation and production of a large number of products, by using only sunlight, water and carbon dioxide (CO2) as raw materials.Through genetic and metabolic engineering, Synechocystis transformants with the ability to produce β-phellandrene, when grown under photoautotrophic conditions without affecting their biomass production as well as photosynthetic activity, were generated. Various fusion constructs of the codon optimized gene of phellandrene synthase (PHLS) along with the gene of geranyl diphosphate synthase (GPPS) with the highly-expressed endogenous cpcB and cpcA genes, encoding the phycocyanin β and α-subunits respectively, were constructed and incorporated into the genomic DNA of Synechocystis. These constructs were expressed under the native cpc operon promoter. Findings of this study indicate that the heterologous expression of GPPS, did enhance the production of β-phellandrene. However, the utilization of a strong promoter (cpc) in combination with the cpcB as a leader sequence seemed not to be sufficient for PHLS protein overexpression levels, when the rest of the cpc operon genes were not present. The cpcB.PHLS fusion protein leads to the heterologous production of β-phellandrene in Synechocystis transformants. On the contrary, the cpcA.PHLS fusion protein was found to lead to the heterologous production of a mixture of terpenoid isomers (δ-3-carene, camphene and α-pinene).In the second part of this thesis, different growth conditions for Synechocystis transformants were examined. Conditions such as higher salinity, alkalinity, CO2 concentration, and light intensity were tested. It was shown that higher alkalinity and salinity did not inhibit the ability of Synechocystis transformants to produce β-phellandrene. Thus, Synechocystis transformant under these conditions could be further exploited for the production of high commercial value products. Furthermore, throughout this study, it has been shown that increased biomass production did not necessarily lead to increased β phellandrene production.Immobilized Synechocystis transformants in calcium alginate beads were found to be able to produce β-phellandrene in significantly larger quantities, compared to free cells, remaining metabolically active for a period of twelve days. These systems provide a renewable perspective for their future application in larger scale bioreactors.The main conclusion of this thesis is that through genetic and metabolic engineering, Synechocystis are capable of heterologous production of a product with high demand and cost in industry by using light, water and CO2. Heterologous β-phellandrene production is just an example that opens new ways for the production of other similarly structured terpenoids with multiple application. The flexibility of these microorganisms to adapt to various growth conditions without affecting their ability to produce β-phellandrene, offers many advantages in their exploitation on an industrial scale to produce such products. The approaches presented in this thesis are renewable, environmentally friendly and economically viable alternatives for the mass production of organic molecules of high industrial value.

Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η ετερόλογη παραγωγή του μονοτερπενίου β φελλανδρενίου από μεταλλαγμένα στελέχη του κυανοβακτηρίου Synechocystis. Το κυανοβακτήριο Synechocystis αποτελεί πρότυπο οργανισμό, ικανό να εφαρμόσει την προσέγγιση «καύσιμα από τη φωτοσύνθεση». Το γεγονός αυτό τον καθιστά μικροοργανισμό κατάλληλο για βιοτεχνολογική εκμετάλλευση και παραγωγή μεγάλου αριθμού προϊόντων, έχοντας ως πρώτες ύλες μόνο φως, νερό και διοξείδιο του άνθρακα. Μέσω της γενετικής και μεταβολικής μηχανικής δημιουργήθηκαν μεταλλαγμένα στελέχη Synechocystis τα οποία ήταν ικανά να παράγουν β-φελλανδρένιο όταν καλλιεργήθηκαν σε φωτοαυτότροφες συνθήκες σε ειδικούς βιοαντιδραστήρες. Η διαδικασία δεν επηρέασε την ανάπτυξη των κυττάρων και τη λειτουργία του φωτοσυνθετικού τους μηχανισμού. Στο γονιδίωμα των στελεχών αυτών εισήχθησαν τα νέα οπερόνια με τα γονίδια σύντηξης του γονιδίου των βελτιστοποιημένων κωδικονίων της συνθάσης του β φελλανδρενίου (PHLS) και του γονιδίου της συνθάσης του πυροφωσφορικού γερανυλίου (GPPS) με τις δύο κύριες υπομονάδες της φυκοκυανίνης (cpcB και cpcA) και εκφράστηκαν κάτω από τη δράση του ισχυρού cpc υποκινητή. Από τα αποτελέσματα προέκυψε πως η ετερόλογη έκφραση της συνθάσης του πυροφωσφορικού γερανυλίου (GPPS), ενισχύει την παραγωγή του β φελλανδρενίου. Αντίθετα η χρήση ενός ισχυρού υποκινητή (cpc), σε συνδυασμό με τη χρήση της cpcB υπομονάδας ως αλληλουχίας οδηγό της PHLS φάνηκε να μην επάγει την έκφραση της σε υψηλότερα επίπεδα, όταν απουσιάζουν γονίδια του cpc οπερονίου. Επιπλέον, παρόλο που η σύντηξη της PHLS με την cpcB υπομονάδα της φυκοκυανίνης οδήγησε σε επιτυχή παραγωγή του β-φελλανδρενίου στα μεταλλαγμένα στελέχη, η συγχώνευση της με την υπομονάδα cpcA της φυκοκυανίνης οδήγησε σε παραγωγή μείγματος ισομερών τερπενοειδών (δ-3-καρένιο, καμφένιο και α-πινένιο). Σε δεύτερη φάση διαφοροποιήθηκαν οι συνθήκες ανάπτυξης των μεταλλαγμένων στελεχών Synechocystis. Οι συνθήκες που δοκιμάστηκαν ήταν η καλλιέργεια των κυττάρων σε θρεπτικό μέσο με υψηλότερη αλκαλικότητα και αλατότητα σε σχέση με τις συνήθεις συνθήκες ανάπτυξης, όπως επίσης η υψηλότερη συγκέντρωση CO2 και φωτονιακή ακτινοβολία. Από τα αποτελέσματα προέκυψε πως η ικανότητα των μεταλλαγμένων στελεχών να παράγουν β-φελλανδρένιο δεν παρεμποδίστηκε από την υψηλότερη αλκαλικότητα και αλατότητα του θρεπτικού μέσου. Τα συμπεράσματα αυτά αποτελούν σημαντικά ευρήματα για την περαιτέρω βιοτεχνολογική εκμετάλλευση μεταλλαγμένων στελεχών Synechocystis για την παραγωγή προϊόντων υψηλής εμπορικής αξίας. Ενδιαφέρον εύρημα της διατριβής ήταν ότι στις συνθήκες που παρατηρήθηκε υψηλότερη παραγωγή κυτταρικής βιομάζας, δεν οδήγησε απαραίτητα σε αύξηση της παραγωγής του β φελλανδρενίου. Ακινητοποιημένα κύτταρα Synechocystis σε σφαιρίδια αλγινικού ασβεστίου ήταν σε θέση να παράγουν β-φελλανδρένιο σε σημαντικά μεγαλύτερες ποσότητες, συγκριτικά με τα ελεύθερα κύτταρα, παραμένοντας μεταβολικά ενεργά για το χρονικό διάστημα των δώδεκα ημερών που μελετήθηκε. Τα συστήματα αυτά δίνουν μία προοπτική για μελλοντική εφαρμογή τους σε μεγαλύτερης κλίμακας βιοαντιδραστήρες.Βασικό συμπέρασμα της παρούσας διατριβής είναι πως μέσω της γενετικής και μεταβολικής μηχανικής, τα κυανοβακτήρια Synechocystis καθίστανται ικανά να παράγουν ένα προϊόν με υψηλή ζήτηση και κόστος στη βιομηχανία έχοντας ως πρώτες ύλες μόνο φως, νερό και διοξείδιο του άνθρακα. Το β-φελλανδρένιο αποτελεί απλά ένα παράδειγμα μονοτερπενίου και η ετερόλογη παραγωγή του ανοίγει νέες προοπτικές για την παραγωγή συγγενικών δομικά τερπενοειδών μορίων με πολλαπλές χρήσεις. Η ευελιξία των μικροοργανισμών αυτών να προσαρμόζονται στις εκάστοτε συνθήκες ανάπτυξης, χωρίς πολλές φορές να επηρεάζεται η ικανότητα τους να παράγουν β φελλανδρένιο προσφέρει αρκετά πλεονεκτήματα όσον αφορά την εκμετάλλευση τους σε βιομηχανική κλίμακα. Οι προσεγγίσεις που παρουσιάστηκαν στην παρούσα διατριβή, αποτελούν ανανεώσιμες, φιλικές προς το περιβάλλον και οικονομικά βιώσιμες εναλλακτικές για τη μαζική παραγωγή οργανικών μορίων υψηλής βιομηχανικής αξίας.