Μελέτη συμπλόκων ρηνίου ως νέων αντικαρκινικών παραγόντων

Abstract

In this PhD thesis, novel rhenium complexes were designed, synthesized and characterized in oxidation states (V) and (I) and were studied for their antitumor activity.In the first category, the rhenium complexes belong to the oxidation state (V) and their general formula is ReO(SNO)(NN) (category 1), where SNO is the tridentate ligand N-(2-mercaptopropionyl)glycine (CH3-SNO) or N-(2-mercaptoacetyl)glycine (SNO) and the NN bidentate ligand is the 2,2'-bipyridine (bpy) or 7-fluorodipyrido[3,2-a:2΄,3΄-c]-phenazine (F-dppz), or benzo[i]bipyrido[3,2-a:2',3'-c]phenazine (dppn), where F-dppz and dppn are intercalators. The complexes with bpy, ReO(CH3-SNO)(bpy) and ReO (SNO) (bpy) were used as reference compounds.All of the oxorhenium complexes (ReO(CH3-SNO) (bpy), ReO(SNO)(bpy), ReO(CH3-SNO)(F-dppz), ReO(SNO)(F-dppz) and ReO(CH3-SNO)(dppn)) were synthesized by reacting the ReOCl3(PPh3)2 precursor with the tridentate and the bidentate ligand in methanol in good yields (70 – 80%). The complexes were characterized by elemental analysis, IR and NMR spectroscopy. The IR and NMR spectroscopies and X-Ray crystallography revealed the existence of two diastereomers syn and anti for the complex with the CH3-SNO tridentate ligand. The structure of the complexes syn-ReO(CH3-SNO)(bpy), anti-ReO(CH3-SNO)(bpy), ReO(SNO)(bpy) and ReO(SNO)(F-dppz) was confirmed by X-Ray crystallography.The oxorhneium complexes were studied for their cytotoxicity against the human cancer cell line, HeLa (cervical) by the MTT method. The ReO(CH3-SNO)(F-dppz) complex exhibited the greatest cytotoxic activity with IC50 ~ 10 μM. The rest of the complexes in this series displayed IC50 values in the same order of magnitude (IC50 = 10.71 ‒ 16.77 μM).Thereafter, rhenium complexes were synthesized in the oxidation state (I) with the general formula [Re(CO)3(NN)L]0/+ (category 2) where the bidentate ligands are the same with the category 1 (F-dppz, dppn) and bromine (Br), acetonitrile (MeCN), cyclohexylisocyanide (cisc) and 1,3,5-triaza-7-phosphadamantane (PTA) were used as monodentate ligands completing the coordination sphere of the metal. The resulting complexes were Re(CO)3(F-dppz)Br, [Re(CO)3(F-dppz)(MeCN)]PF6, [Re(CO)3(F-dppz)(cisc)]PF6, [Re(CO)3(F-dppz)(PTA)]PF6, Re(CO)3(dppn)Br, [Re(CO)3(dppn)(cisc)]PF6 and [Re(CO)3(dppn)(PTA)]PF6.[108]The cationic complexes [Re(CO)3(F-dppz)(MeCN)]PF6 and [Re(CO)3(dppn)(MeCN)]PF6 were obtained by reacting the corresponding neutral complexes Re(CO)3(F-dppz)Br and Re(CO)3(dppn)Br with AgPF6 in acetonitrile. The [Re(CO)3(F-dppz)(MeCN)]PF6 and [Re(CO)3(dppn)(MeCN)]PF6 were used as intermediate complexes by reacting them with the monodentate ligands cisc or PTA in chloroform or methanol. The cationic complexes [Re(CO)3(F-dppz)(cisc)]PF6, [Re(CO)3(F-dppz)(PTA)]PF6, [Re(CO)3(dppn)(cisc)]PF6 and [Re(CO)3(dppn)(PTA)]PF6 were synthesized in high yields (77 – 91%). The complexes were characterized by elemental analysis, IR and NMR spectroscopy. The structure of [Re(CO)3(F-dppz)(MeCN)]PF6 was confirmed by X-ray crystallography.The cytotoxicity of the complexes of category 2 was studied against human cancer cell lines HeLa (cervical) and MCF-7 (breast). The complexes Re(CO)3(F-dppz)(cisc) and Re(CO)3(dppn)(cisc) showed the highest toxicity (IC50 = 0.13 - 6.14 μM) against both cancer cell lines.In the third and last category, the general formula of the complexes is fac-[Re(CO)3(NNbz)L]0/+ (category 3) where the bidentate ligand is the 4-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N-(pyridin-2-ylmethyl)aniline) (NNbz) and as monodenate ligands were used bromine (Br), acetonitrile (MeCN), cyclohexylisocyanide (cisc), triphenylphosphine (PPh3), 1,3,5-triaza-7-phosphadamantane (PTA) and pyridine (py). The resulting complexes were Re(CO)3(NNbz)Br, [Re(CO)3(NNbz)(MeCN)]PF6, [Re(CO)3(NNbz)(cisc)]PF6, [Re(CO)3(NNbz)(PPh3)]PF6, [Re(CO)3(NNbz)(PTA)]PF6 and [Re(CO)3(NNbz)(py)]PF6.The cationic complex [Re(CO)3(NNbz)(MeCN)]PF6 was used as the intermediate complex and resulted from the reaction of the neutral complex Re(CO)3(NNbz)Br with AgPF6 in acetonitrile. The intermediate complex [Re(CO)3(NNbz)(MeCN)]PF6 reacts with the monodentate ligands cisc or PPh3 or PTA or py in chloroform or methanol to give the cationic complexes [Re(CO)3(NNbz)(cisc)]PF6, [Re(CO)3(NNbz)(PPh3)]PF6, [Re(CO)3(NNbz)(PTA)]PF6 and [Re(CO)3(NNbz)(py)]PF6. The complexes were synthesized in high yields (81‒94%) and characterized by IR, NMR and elemental analysis. The structure of the Re(CO)3(NNbz)Br, [Re(CO)3(NNbz)(OH2)]PF6, [Re(CO)3(NNbz)(PPh3)]PF6 and [Re(CO)3(NNbz)(PTA)]PF6 was confirmed by X-ray crystallography.The cellular uptake studies using fluorescence microscopy revealed that the complexes penetrate the cell membrane and diffuse into the cytoplasm.[109]Moreover, the cytotoxicity of the complexes of the category 3 were tested in human cancer cell lines, HeLa (cervical), MCF-7 (breast) and A431 (epidermoid) by the MTT method. The results were very encouraging. The complexes with the highest cytotoxicity against the cancer cell lines were Re(CO)3(NNbz)(cisc) and Re(CO)3(NNbz)(PPh3) (IC50 = 0.19 ‒ 0.61 μM).In addition, the interaction of all the complexes with CT-DNA was achieved by circular dichroism, competitive fluorescence studies and viscometry. The results suggest the strong interaction between the complexes and DNA via intercalation.Morover, cell cycle studies were performed for the complexes of category 3. The complex Re(CO)3(NNbz)(cisc) was found to increase the cell population in both the G1 and G2 phase by completely disruption of the cell cycle in the HeLa and MCF-7 cancer cell lines. The rest of the complexes increase the cell population in the G2/M phase.Furthermore, 99mTc(CO)3(NNbz)(cisc) was successfully synthesized in high yield (> 95%) using the precursor [99mTc(CO)3(OH2)]+. The in vivo biodistribution studies of 99mTc(CO)3(NNbz)(cisc) in healthy and SCID mice bearing tumor showed satisfactory uptake of the complex in tumor.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή σχεδιάστηκαν, συντέθηκαν και χαρακτηρίστηκαν πλήρως νέα σύμπλοκα του ρηνίου τόσο στην οξειδωτική βαθμίδα (V) όσο και στην οξειδωτική βαθμίδα (Ι) και μελετήθηκαν ως προς την αντικαρκινική τους δράση.Στην πρώτη κατηγορία συμπλόκων του ρηνίου που μελετήθηκε, ανήκουν σύμπλοκα στην οξειδωτική βαθμίδα (V) του γενικού τύπου ReO(SNO)(NN) (κατηγορία 1), όπου SNO είναι ο τριδοτικός υποκαταστάτης Ν-(2-μερκαπτοπροπιονυλ)γλυκίνη (CH3-SNO) ή Ν-(2-μερκσπτοακετυλ)γλυκίνη (SNO) και ΝΝ o διδοτικός υποκαταστάτης 2,2’-διπυριδίνη (bpy), ή 7-φθοροδιπυριδο[3,2-a:2΄,3΄-c]φαιναζίνη (F-dppz), ή βενζο[i]διπυριδο[3,2-a:2',3'-c]φαιναζίνη (dppn), όπου το F-dppz και dppn είναι μόρια – παρεμβολείς. Τα οξορρηνικά σύμπλοκα με τη bpy, (ReO(CH3-SNO)(bpy) και ReO(SNO)(bpy)) χρησιμοποιήθηκαν ως ενώσεις αναφοράς.Όλα τα οξορρηνικά σύμπλοκα (ReO(CH3-SNO)(bpy), ReO(SNO)(bpy), ReO(CH3-SNO)(F-dppz) ReO(SNO)(F-dppz), ReO(CH3-SNO)(dppn)) συντέθηκαν με αντίδραση του πρόδρομου συμπλόκου ReOCl3(PPh3)2 με τον τριδοτικό και τον διδοτικό υποκαταστάτη σε μεθανόλη με καλές αποδόσεις (70 – 80 %). Τα σύμπλοκα χαρακτηρίστηκαν με στοιχειακή ανάλυση, IR και NMR φασματοσκοπία. Από τις φασματοσκοπίες IR και NMR καθώς και από την κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ έγινε φανερή η ύπαρξη δύο διαστερεομερών syn και anti για τα σύμπλοκο που έχουν τον CH3-SNO ως τριδοτικό υποκαταστάτη. Η δομή των συμπλόκων syn-ReO(CH3-SNO)(bpy), anti-ReO(CH3-SNO)(bpy), ReO(SNO)(bpy) και ReO(SNO)(F-dppz) επιβεβαιώθηκε με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ.Τα οξορρηνικά σύμπλοκα μελετήθηκαν ως προς την δράση τους έναντι της ανθρώπινης καρκινικής κυτταρικής σειράς HeLa (τραχήλου της μήτρας) μέσω της μεθόδου ΜΤΤ. Το σύμπλοκο ReO(CH3-SNO)(F-dppz) εμφάνισε τη μεγαλύτερη δραστικότητα με ΙC50 ~ 10 μΜ. Τα υπόλοιπα σύμπλοκα της σειράς εμφάνισαν τιμές ΙC50 στην ίδια τάξη μεγέθους (ΙC50 = 10.71 ‒ 16.77 μΜ).Εν συνεχεία συντέθηκαν σύμπλοκα του ρηνίου στην οξειδωτική βαθμίδα (Ι) με γενικό τύπο fac-[Re(CO)3(NN)L]0/+ (κατηγορία 2) όπου οι διδοτικοί υποκαταστάτες είναι τα μόρια – παρεμβολείς της κατηγορίας 1 (F-dppz, dppn) και ως μονοδοτικοί υποκαταστάτες χρησιμοποιήθηκαν το βρώμιο (Br), το ακετονιτρίλιο (MeCN), το κυκλοεξυλισοκυανίδιο (cisc) και το 1,3,5-τριαζα-7-φωσφαδαμαντάνιο (ΡΤΑ) έτσι ώστε να συμπληρωθεί η σφαίρα[104]συναρμογής του μετάλλου. Τα σύμπλοκα που προέκυψαν ήταν τα Re(CO)3(F-dppz)Br, [Re(CO)3(F-dppz)(MeCN)]PF6, [Re(CO)3(F-dppz)(cisc)]PF6, [Re(CO)3(F-dppz)(PTA)]PF6, Re(CO)3(dppn)Br, [Re(CO)3(dppn)(MeCN)]PF6, [Re(CO)3(dppn)(cisc)]PF6 και [Re(CO)3(dppn)(PTA)]PF6.Τα κατιοντικά σύμπλοκα [Re(CO)3(F-dppz)(MeCN)]PF6 και [Re(CO)3(dppn)(MeCN)]PF6 προέκυψαν από αντίδραση των αντίστοιχων ουδέτερων συμπλόκων Re(CO)3(F-dppz)Br και Re(CO)3(dppn)Br με τον AgPF6 σε διαλύτη ακετονιτρίλιο. Τα σύμπλοκα [Re(CO)3(F-dppz)(MeCN)]PF6 και [Re(CO)3(dppn)(MeCN)]PF6 χρησιμοποιήθηκαν ως ενδιάμεσα σύμπλοκα και με αντίδρασή τους με τον μονοδοτικό υποκαταστάτη cisc ή PTA σε χλωροφόρμιο ή μεθανόλη προκύπτουν τα κατιοντικά σύμπλοκα [Re(CO)3(F-dppz)(cisc)]PF6, [Re(CO)3(F-dppz)(PTA)]PF6, [Re(CO)3(dppn)(cisc)]PF6 και [Re(CO)3(dppn)(PTA)]PF6. Οι αποδόσεις των συμπλόκων ήταν υψηλές (77 – 91%). Ο χαρακτηρισμός των συμπλόκων έγινε με στοιχειακή ανάλυση, IR και NMR φασματοσκοπία. Η δομή του [Re(CO)3(F-dppz)(MeCN)]PF6 επιβεβαιώθηκε με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ.Τα σύμπλοκα της κατηγορίας 2 μελετήθηκαν ως προς την δράση τους έναντι των ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών HeLa (τραχήλου της μήτρας) και MCF-7 (μαστού). Tα σύμπλοκα Re(CO)3(F-dppz)(cisc) και Re(CO)3(dppn)(cisc) είχαν τη μεγαλύτερη δραστικότητα (ΙC50 = 0.13 – 6.14 μΜ) έναντι και των δυο καρκινικών κυτταρικών σειρών.Στην τρίτη και τελευταία κατηγορία, ο γενικός των τύπος των συμπλόκων είναι fac-[Re(CO)3(NNbz)L]0/+ (κατηγορία 3) όπου ως ΝΝ διδοτικός υποκαταστάτης χρησιμοποιείται το παράγωγο του βενζοθειαζολίου 4-(βενζο[d]θειαζολ-2-yl)-N-(πυριδιν-2-yl-μεθυλ)ανιλίνη) (NNbz) και ως μονοδοτικοί υποκαταστάτες το βρώμιο (Br), το ακετονιτρίλιο (MeCN), το κυκλοεξυλισοκυανίδιο (cisc), η τριφαινυλοφωσφίνη (PPh3), το 1,3,5-τριαζα-7-φωσφαδαμαντάνιο (PTA) και η πυριδίνη (py). Τα σύμπλοκα που προέκυψαν ήταν τα Re(CO)3(ΝΝbz)Br, [Re(CO)3(NNbz)(MeCN)]PF6, [Re(CO)3(NNbz)(cisc)]PF6, [Re(CO)3(NNbz)(PPh3)]PF6, [Re(CO)3(NNbz)(PTA)]PF6 και [Re(CO)3(ΝΝbz)(py)]PF6.Το κατιοντικό σύμπλοκο [Re(CO)3(NNbz)(MeCN)]PF6 χρησιμοποιήθηκε ως ενδιάμεσο σύμπλοκο και προέκυψε από αντίδραση του ουδέτερου συμπλόκου Re(CO)3(ΝΝbz)Br με τον AgPF6 σε διαλύτη ακετονιτρίλιο. Το ενδιάμεσο σύμπλοκο [Re(CO)3(NNbz)(MeCN)]PF6 αντιδρά με τους μονοδοτικούς υποκαταστάτες cisc ή PPh3 ή PTA ή py σε διαλύτη χλωροφόρμιο ή μεθανόλη και προκύπτουν τα κατιοντικά σύμπλοκα[105][Re(CO)3(NNbz)(cisc)]PF6, [Re(CO)3(NNbz)(PPh3)]PF6, [Re(CO)3(NNbz)(PTA)]PF6 και [Re(CO)3(ΝΝbz)(py)]PF6. Οι αποδόσεις των συμπλόκων ήταν υψηλές 81 – 94%. Ο χαρακτηρισμός των συμπλόκων έγινε με φασματοσκοπία IR, NMR, και στοιχειακή ανάλυση. Η δομή των συμπλόκων Re(CO)3(NNbz)Βr, [Re(CO)3(NNbz)(ΟΗ2)]PF6, [Re(CO)3(NNbz)(PPh3)]PF6 και [Re(CO)3(NNbz)(PTA)]PF6 επιβεβαιώθηκε με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ.Οι μελέτες κυτταρικής πρόσληψης που ακολούθησαν αποκάλυψαν ότι τα σύμπλοκα περνούν την κυτταρική μεμβράνη και υπάρχουν διάχυτα στο κυτταρόπλασμα.Επίσης, τα σύμπλοκα της κατηγορίας 3 μελετήθηκαν ως προς την δράση τους έναντι των ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών, HeLa (τραχήλου της μήτρας), MCF-7 (μαστού) και Α431 (επιδερμοειδές), μέσω της μεθόδου ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα ήταν ιδιαιτέρως ενθαρρυντικά. Συγκεκριμένα, τα σύμπλοκα που εμφάνισαν τη μεγαλύτερη δραστικότητα είναι τα Re(CO)3(NNbz)(cisc) και Re(CO)3(NNbz)(PPh3) (IC50 = 0.19 - 0.61 μM).Επίσης, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση των συμπλόκων και των τριων κατηγοριών με DNA θύμου αδένα βοοειδούς μέσω κυκλικού διχρωϊσμού, ανταγωνιστικών μελετών φθορισμού και ιξωδομετρίας όπου φαίνεται ότι όλα τα σύμπλοκα αλληλεπιδρούν ισχυρά με το DNA μέσω ενδοπαρεμβολής.Ακολούθως, πραγματοποιήθηκαν μελέτες κυτταρικού κύκλου για τα σύμπλοκα της κατηγορίας 3. Πολύ ενδιαφέροντα αποτελέσματα είχε το σύμπλοκο Re(CO)3(NNbz)(cisc) το οποίο βρέθηκε ότι προκαλεί αύξηση της κατανομής του κυτταρικού πληθυσμού τόσο στη G1 όσο και στη G2 φάση διαταράσσοντας πλήρως τον κυτταρικό κύκλο στις καρκινικές κυτταρικές σειρές ΗeLa και ΜCF-7. Τα υπόλοιπα σύμπλοκα προκαλούν αύξηση της κατανομής του κυτταρικού πληθυσμού στη φάση G2/M.Τέλος, παρασκευάστηκε επιτυχώς το 99mTc(CO)3(NNbz)(cisc) σε υψηλή απόδοση (>95%) χρησιμοποιώντας ως πρόδρομο σύμπλοκο το [99mTc(CO)3(OH2)]+. Ακολούθησαν in vivo μελέτες βιοκατανομής του 99mTc(CO)3(NNbz)(cisc) σε υγιή ποντίκια και σε ποντίκια που φέρουν όγκο με τα αποτελέσματα να δείχνουν ικανοποιητική πρόσληψη ραδιενέργειας του συμπλόκου στον όγκο.