Πρότυπα λειτουργίας ανοσολογικού συστήματος μετά από μεταμόσχευση αλλογενών αιμοποιητικών κυττάρων

Abstract

Immune reconstitution post allogeneic hematopoetic transplantation (allo-HCT) occurs sequentially for different cell populations and depends on factors that are patient-related (age, disease), graft- or complication- related (Graft Versus Host Disease, GvHD, infections). Delayed immune reconstitution involves a delay in the recovery of a broad, representative T lymphocyte repertoire, active against several immune pathogens. Immunodeficiency leads to major complications, such as infections, relapse and secondary malignancies. Post transplantation expansions of T cytotoxic lymphocytes have been widely discussed in the literature. They represent a wide spectrum of lymphoproliferations, ranging from polyclonal transient expansions to persisting monoclonal malignancies of T Large granular lymphocytes, LGLs. It is implied that in immunocompromized patients a chronic antigenic stimuli (malignancy or virus) can disrupt immune-surveillance and give rise to excessive lymphoproliferations. Similar T-LGL expansions have been described from our group in patients with malignancy after Rituximab administration. In order to elucidate the dynamic evolution of a transient polyclonal lymphoproliferation into a clonal population we studied the immune reconstitution of allo- transplanted patients post Rituximab administration, by extensive immunoprofilling of the variable region of β chain of T cell receptor (TR). Fourteen patients who underwent allo-HCT from a sibling or matched volunteer donor and received Rituximab were included in the study. Bone marrow samples were analyzed at a median of 5 months (range 1-23) post Rituximab and 18 months (range 4-64) post allo-HCT. In two patients samples pre- and post Rituximab were studied. In patients with lymphocytosis or unexplained neutropenia lymphocyte subpopulations were studied with flow cytometry in parallel. Immunoprofiling of TR consisted of PCR amplification of the variable region of β chain, cloning and Sanger sequencing. Immunogenetic analysis was performed using imgt tools. In total, flow cytometry revealed a low ratio of CD4/CD8 and complete absence of B-cells. Most of the patients presented with increased number of CD8+ cells (>1.0 x 109/L in 6/9 patients) and increased (>30%) percentage of CD3+CD8+CD57+ Τ-LGLs (>30% in 7/9 patients). Molecular profiling consisted of 288 productive TRBV-TRBD-TRBJ gene rearrangements in 17 samples (6–91/ sample, median: 14). Longitudinal samples were analyzed in two patients. A remarkable skewing in the use of TRBV genes was observed, with 3 TRBV genes accounting for almost half of the total repertoire of TRBV-TRBD-TRBJ gene rearrangements(TRBV6-5*01: 32%, TRBV27*01: 11.4% και TRBV19-01: 7.6%). Expanded clonotypes (>=2 similar rearrangements) were detected in all patients. In 7/14 patients more than half of the TR gene repertoire consisted of 2-3 expanded clonotypes. To study clinicobiological correlations, we restricted the analysis to 9 patients in whom at least 10 productive rearrangements were available. Oligoclonality was even more pronounced: in seven of 9 patients Τ repertoires, consisted of expanded clonotypes at a median of 89% of all identified rearrangements (range 66-100%). Viral reactivation could be related to oligoclonality: all patients with oligoclonality but none with a polyclonal background experienced EBV reactivation and 4/7 oligoclonal vs 1/2 polyclonal experienced CMV reactivation. Six of 7 patients with oligoclonal versus 1/2 patients with polyclonal repertoire presented chronic GvHD. One patient with a remarkably oligoclonal repertoire at +3 and +12 months eventually developed T-LGL leukemia of donor origin 8 years post allo-HCT by expansion of TRBV2*01/TRBD1*01/TRBJ1-5*01 clonotype. Distinct clonotypes predominated at different time-points, suggesting clonal drift. The patient had a symptomatic T-LGL leukemia of donor origin along with a low donor chimerism in the bone marrow, without ever experiencing a relapse from the underlying Ph+ ALL. In conclusion, we report the frequent development of oligoclonal cytotoxic T-cell populations after Rituximab treatment post allo-HCT, likely of multifactorial origin. The observed association of oligoclonality with GvHD and the development of a possible “T-LGL leukemia vs leukemia” effect in one patient implies an anti-leukemic effect of this phenomenon. Finally, the observed skewing of the TR gene repertoire strongly implicates antigen selection in the development of cytotoxic T-LGL expansions after allo-HCT.

Η άνοση αποκατάσταση μετά από την αλλογενή μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων (allogeneic hematopoietic transplantation, allo-HCT) συμβαίνει σε διαφορετικά χρονικά σημεία για τους λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς και επηρεάζεται από παράγοντες που σχετίζονται με τον ασθενή και το είδος μεταμόσχευσης αλλά και με τις επιπλοκές της, όπως η χρόνια νόσος του μοσχεύματος έναντι του ξενιστή (Graft Versus Host Disease, GvHD) και οι λοιμώξεις. Η καθυστερημένη αποκατάσταση των κυττάρων δεν είναι μόνο ποσοτική αλλά και ποιοτική, εφόσον καθυστερεί η δημιουργία ενός ευρέος, αντιπροσωπευτικού ρεπερτορίου Τ λεμφοκυττάρων, ικανού να αντιμετωπίσει μια πληθώρα παθογόνων. Η ανοσοανεπάρκεια αυτή, εκτός από την ανάπτυξη λοιμώξεων, συμβάλλει και σε επιπλοκές όπως η υποτροπή της νόσου μέσω της περιορισμένης δράσης μοσχεύματος κατά λευχαιμίας αλλά και η εμφάνιση δευτεροπαθών κακοηθειών. Η ανάπτυξη Τ κυτταροτοξικών πληθυσμών μετά από αλλογενή μεταμόσχευση έχει αναφερθεί σε πολλές μελέτες και περιγράφεται ως ένα ευρύ φάσμα λεμφοϋπερπλασιών που ποικίλλουν από πολυκλωνικές παροδικές υπερπλασίες εώς εμμένουσες μονοκλωνικές κακοήθειες από λεμφοκύτταρα με μορφολογία μεγάλων κοκκιωδών λεμφοκυττάρων (Large granular lymphocytes, LGLs). Παθογενετικά πιθανολογείται ότι η μείζων ανοσοκαταστολή μπορεί να βλάψει την ανοσοεπιτήρηση και σε συνδυασμό με χρόνιο αντιγονικό ερεθισμό από νεοπλασματικά αντιγόνα, αντιγόνα μοσχεύματος ή παθολογικές πρωτεΐνες να πυροδοτήσουν την έναρξη της λευμφοϋπερπλασίας. Παρόμοιες λεμφοϋπερπλασίες των T-LGLs έχουν περιγραφεί από την ομάδα μας σε ασθενείς με αιματολογικές κακοήθειες μετά από τη θεραπεία με Rituximab.Προκειμένου να κατανοήσουμε τη δυναμική εξέλιξη μίας παροδικής πολυκλωνικής λεμφοϋπερπλασίας σε κλωνικό πληθυσμό, θελήσαμε να μελετήσουμε την αποκατάσταση της ανοσολογικής λειτουργίας ασθενών που μετά από allo-HCT έχουν υποβληθεί σε πολυπαραγοντικό αντιγονικό ερεθισμό και έχουν εκτεθεί στην επίδραση του ανοσοτροποποιητικού μονοκλωνικού αντισώματος Rituximab, μέσω της εκτενούς ανάλυσης του ρεπερτορίου της μεταβλητής περιοχής της β αλυσίδας του Τ κυτταρικού υποδοχέα (TR). Για τον σκοπό αυτό μελετήθηκαν συνολικά 14 ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε allo-HCT είτε από συγγενή δότη είτε από εθελοντή ξένο δότη και έλαβαν Rituximab μετά τη μεταμόσχευση. Αναλύθηκαν δείγματα μυελού 1-23 (διάμεση τιμή = 5) μήνες μετά τη χορήγηση του Rituximab και 4-64 (διάμεση τιμή = 18) μήνες μετά από αλλογενή μεταμόσχευση. Σε δύο ασθενείς μελετήθηκαν διαχρονικά δείγματα πριν και μετά τη χορήγηση Rituximab. Σε ασθενείς με λεμφοκυττάρωση ή ανεξήγητη ουδετεροπενία παράλληλα διενεργήθηκε και ανάλυση των λεμφοκυτταρικών πληθυσμών με κυτταρομετρία ροής. Η μελέτη του ρεπερτορίου του Τ κυτταρικού υποδοχέα έγινε με ενίσχυση της μεταβλητής περιοχής της β αλυσίδας του TR με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, καθαρισμό και κλωνοποίηση των προϊόντων της αντίδρασης, αλληλούχηση και ανοσογενετική βιοπληροφορική ανάλυση. Αναζητήθηκαν κλινικοβιολογικές συσχετίσεις.Από την ανάλυση των υποπληθυσμών των λεμφοκυττάρων παρατηρήθηκε στο σύνολο των ασθενών ανεστραμμένος λόγος των CD4/ CD8 και απαλοιφή των Β κυττάρων και στην πλειονότητά τους αύξηση των CD8+ κυττάρων>1.0 x 109/L (σε 6/9 ασθενείς) και αυξημένο ποσοστό (>30%) κυτταροτοξικών κυττάρων με φαινότυπο Τ-LGL (CD3+CD8+CD57+) (7/9 ασθενείς που μελετήθηκαν). Η μοριακή ανάλυση οδήγησε σε 288 παραγωγικές γονιδιακές αναδιατάξεις TRBV-TRBD-TRBJ σε 17 δείγματα (6–91/ δείγμα, διάμεση τιμή: 14). Σε δύο ασθενείς αναλύθηκαν διαχρονικά δείγματα. Παρατηρήθηκαν: i) αξιοσημείωτη επιλεκτικότητα του Τ ρεπερτορίου στη χρήση του TRBV γονιδίου, με αντιστοίχιση 3 γονιδίων TRBV στο ήμισυ του ολικού ρεπερτορίου (TRBV6-5*01 32%, TRBV27*01 11.4% και TRBV19-01 7.6%), ii) ολιγοκλωνικοί λεμφοκυτταρικοί πληθυσμοί σε 7 ασθενείς, στους οποίους το γονιδιακό ρεπερτόριο του TR αποτελούνταν τουλάχιστον κατά 50% μόνο από 2-3 εκπτυγμένους κλωνοτύπους. Η αναζήτηση κλινικά σημαντικών συσχετίσεων έγινε μεταξύ των πλήρως μελετημένων ασθενών, όπως θεωρήθηκαν αυτοί στους οποίους αναλύθηκαν τουλάχιστον 10 παραγωγικές TRBV-TRBD-TRBJ αναδιατάξεις. Μεταξύ αυτών η ολιγοκλωνικότητα ήταν πιο εκσεσημασμένη, εφόσον σε 7/9 ασθενείς οι κλωνοτύποι αντιστοιχούσαν στο 89% κατά διάμεση τιμή όλων των αναδιατάξεων (διακύμανση 66-100%), Η ολιγοκλωνικότητα του ρεπερτορίου σχετίστηκε με i) ιογενείς λοιμώξεις ( 7/7 ολιγοκλωνικοί ασθενείς vs 0/2 πολυκλωνικοί παρουσίασαν αναζωπύρωση της EBV λοίμωξης και 4/7 ολιγοκλωνικοί ασθενείς vs 1/2 πολυκλωνικοί παρουσίασαν CMV αναζωπύρωση) και ii) τη χρόνια GvHD (σε 6/7 ολιγοκλωνικούς ασθενείς vs 1/2 πολυκλωνικούς). Σε δύο ασθενείς με πολυπαραγοντικό αντιγονικό ερεθισμό μελετήσαμε διαχρονικά δείγματα (πριν και μετά τη χορήγηση Rituximab). Αξιοσημείωτο είναι ότι στον έναν ασθενή ο κλωνοτύπος TRBV2*01/TRBD1*01/TRBJ1-5*01 εκπτύχθηκε διαχρονικά και 8 έτη μετά από την allo-HCT έγινε ο επικρατής κλωνοτύπος, υπεύθυνος για την εκδήλωση της T-LGL λευχαιμίας. Στον ασθενή αυτόν η T-LGL λευχαιμία αναπτύχθηκε στα κύτταρα του δότη, ενώ παρέμεινε σε πλήρη ύφεση από την υψηλού ρίσκου οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία, παρά την επανεμφάνιση μικτού χιμαιρισμού ως προς την συνολική αιμοποιϊα. Συμπερασματικά, στην παρούσα μελέτη αναφέρουμε τη συχνή ανάπτυξη ολιγοκλωνικών Τ κυτταροτοξικών πληθυσμών μετά τη χορήγηση Rituximab στα πλαίσια της αλλογενούς μεταμόσχευσης αιμοποιητικών κυττάρων, πιθανώς πολυπαραγοντικής αιτιολογίας. Η παρατηρούμενη συσχέτιση της GvHD με την ολιγοκλωνικότητα είναι έμμεση ένδειξη της αντι-λευχαιμικής δράσης αυτών των κυττάρων. Η πιθανή δράση «λευχαιμίας έναντι λευχαιμίας» σε έναν ασθενή μας ενισχύει αυτή τη θεωρία. Τέλος, η ισχυρή επιλεκτικότητα του ρεπερτορίου του Τ υποδοχέα στην ομάδα μελέτης, μετά από πολυπαραγοντική αντιγονική επίδραση, αναδεικνύει την ισχυρή αντιγονική πίεση ως αιτία ανάπτυξης των Τ-LGL λευχαιμικών κλώνων.