Ανάπτυξη και αξιολόγηση συστήματος ανθρωποποιημένων ποντικών ως προκλινικό μοντέλο καινοτόμων αντικαρκινικών ανοσοθεραπειών

Abstract

Cancer immunotherapy engages a patient’s own immune system in the fight against tumors. Checkpoint blockade inhibitors, cancer vaccines and other immunotherapeutic modalities have shown promising results in multiple malignancies. However, a significant percentage of patients still do not benefit from immunotherapy due to a number of reasons. On one hand, variability in patient responses due to HLA polymorphism, individuality of antigens (i.e. cancer neo-antigens) and uniqueness of the tumor microenvironment’s immunosuppressive nature per se highlight the need for more personalized approaches in antigenic epitope discovery. In this direction, mass spectrometry (MS)- based immunopeptidomics have facilitated the direct identification of potential therapeutic candidates. On the other hand, current pre-clinical models often prove to be inadequate as immunotherapeutic tools, since they only partially recapitulate the clinical reality of human cancers. Therefore, mice with human components, including patient-derived tumors and / or a complete human immune system provide a more suitable setting for the development and testing of new immunotherapies. In this thesis, we developed various humanized mouse models, namely, patient derived xenograft (PDX) mice from various tumor types, as well as human immune system (HIS) and bone- liver-thymus (BLT) mice that have developed a functional human immune system. We then explored their potential as pre-clinical models for tumor immunotherapy. In one study, we established an epithelial ovarian cancer PDX model, in which we assessed the efficacy of T cell responses elicited in patients vaccinated with an autologous dendritic cell-based vaccine. In a second set of experiments, we developed and optimized a HIS mouse model for application in checkpoint blockade inhibition studies, where engrafted non-small cell lung cancer tumors were treated with blocking human anti-PD-1 monoclonal antibodies. Last but not least, we introduced the use of a humanized mouse model for antigen discovery and immunogenicity validation. As a proof of concept, BLT mice were vaccinated with an H5N1 influenza virus, which elicited strong virus-specific immune responses. Mass-spectrometry-based immunopeptidomic analysis identified multiple virus-derived human leukocyte antigen (HLA) class I and II ligands presented by the in vivo generated human antigen presenting cells (APCs) loaded with virus. Their immunogenicity was validated in ex vivo experiments that revealed predominantly CD4+ T cell responses against multiple ligands. Thus, for the first time we describe the application of immunopeptidomics on a humanized mouse model as a novel strategy for the discovery of patient specific, clinically-relevant targets. In summary, using different approaches we provided evidence that humanized mice constitute superior models for epitope discovery and immunotherapeutic studies in a human context in vivo.

Στις ανοσοθεραπευτικές προσεγγίσεις κατά του καρκίνου αξιοποιείται το ανοσοποιητικό σύστημα του ίδιου του ασθενούς στη μάχη κατά της ογκογένεσης. Οι αναστολείς των σημείων ελέγχου του ανοσοποιητικού συστήματος, τα αντικαρκινικά εμβόλια και άλλες ανοσοθεραπευτικές φόρμουλες έχουν δείξει ιδιαίτερα ελπιδοφόρα αποτελέσματα ενάντια σε πολλούς τύπους καρκίνου. Ωστόσο, ένα σημαντικό ποσοστό ασθενών εξακολουθεί να μην επωφελείται από αυτές τις θεραπείες εξαιτίας μιας σειράς παραγόντων. Οι διαφορετικές αποκρίσεις των ασθενών στις θεραπείες οφείλονται σε πολυμορφισμούς στα αντιγόνα ιστοσυμβατότητας, στη μοναδικότητα ορισμένων αντιγόνων (όπως για παράδειγμα τα νεο-αντιγόνα), αλλά και του ανοσοκατασταλτικού μικροπεριβάλλοντος του όγκου και τονίζουν την έντονη ανάγκη για πιο εξατομικευμένες προσεγγίσεις στην εύρεση νέων επιτόπων. Σε αυτή την κατεύθυνση, η εφαρμογή της φασματομετρίας μάζας στην αναγνώριση ανοσο-πεπτιδίων έχει διευκολύνει ιδιαίτερα την ταυτοποίηση νέων υποψηφίων θεραπευτικών στόχων. Ακόμη, τα ήδη υπάρχοντα πειραματικά μοντέλα στα οποία δοκιμάζονται οι φαρμακευτικές αγωγές αποδεικνύονται συχνά ανεπαρκή, καθώς δεν αντικατοπτρίζουν πλήρως την κλινική εικόνα των ανθρώπινων όγκων. Κατά συνέπεια, αναπτύχθηκαν μοντέλα ποντικών με ανθρώπινα στοιχεία, όπως βιοψίες ασθενών ή/ και ένα ολοκληρωμένο και λειτουργικό ανθρώπινο ανοσοποιητικό σύστημα. Στην παρούσα διατριβή, αναπτύξαμε αρκετά τέτοιου είδους μοντέλα ανθρωποποιημένων ποντικών και πιο συγκεκριμένα, μοντέλα με μοσχεύματα όγκων προερχόμενων από ασθενείς, μοντέλα ποντικών με ανθρώπινο ανοσοποιητικό σύστημα, καθώς και μοντέλα ποντικών με ανθρώπινο ανοσοποιητικό σύστημα και θύμο αδένα. Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε τις προοπτικές τους ως προκλινικά μοντέλα αντικαρκινικών ανοσοθεραπευτικών προσεγγίσεων. Σε έναν πρώτο κύκλο πειραμάτων, δημιουργήσαμε ένα μοντέλο βιοψίας επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών, ώστε να αξιολογήσουμε τις αποκρίσεις αυτόλογων Τ λεμφοκυττάρων, τα οποία προέρχονταν από ασθενείς που είχαν εμβολιαστεί με ένα θεραπευτικό εμβόλιο δενδριτικών κυττάρων. Σε μια δεύτερη σειρά πειραμάτων, αναπτύξαμε ανθρωποποιημένα ποντίκια για την εφαρμογή αναστολέων των σημείων ελέγχου του ανοσοποιητικού συστήματος. Συγκεκριμένα, σε ποντίκια με ανθρώπινο ανοσοποιητικό σύστημα αναπτύχθηκαν όγκοι μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα και στη συνέχεια χορηγήθηκε αντίσωμα εναντίον του αναστολέα προγραμματισμένου θανάτου 1. Τέλος, εισήγαμε για πρώτη φορά τη χρήση ανθρωποποιημένων ποντικιών για την ταυτοποίηση αντιγόνων και την επιβεβαίωση της ανοσογονικότητάς τους. Για να επιβεβαιώσουμε την ορθότητα της ιδέας, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο ποντικού με ανθρώπινο ανοσοποιητικό σύστημα και θύμο αδένα, στο οποίο χορηγήθηκε εμβόλιο για τον ιό της γρίπης Η5Ν1. Με τη χρήση φασματομετρίας μάζας ταυτοποιήσαμε πολλαπλά πεπτίδια ιικής προέλευσης, τα οποία παρουσιάζονται από τα αντιγόνα ιστοσυμβατότητας τάξης Ι και ΙΙ στα ανθρώπινα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα που αναπτύσσονται στα ποντίκια. Η ανοσογονικότητα των πεπτιδίων επιβεβαιώθηκε με δοκιμασίες Τ λεμφοκυττάρων, όπου αποδείχτηκε η ειδικότητά τους κυρίως για βοηθητικά Τ λεμφοκύτταρα. Επομένως, περιγράφουμε για πρώτη φορά την εφαρμογή φασματομετρίας μάζας στην αναγνώριση επιτόπων σε ανθρωποποιημένα ποντίκια και την προτείνουμε ως καινοτόμο μέθοδο για την ανακάλυψη εξατομικευμένων θεραπευτικών στόχων. Εν κατακλείδι, παραθέτουμε στοιχεία μέσω διαφορετικών προσεγγίσεων ότι τα ανθρωποποιημένα ποντίκια αποτελούν εξαιρετικά προκλινικά μοντέλα για την ταυτοποίηση θεραπευτικών επιτόπων και την μελέτη ανοσοθεραπειών σε ανθρώπινο πλαίσιο.