Ανάπτυξη μικρο-αναλυτικών και διαγνωστικών μεθόδων με χρήση εντυπωμένων μικρορευστονικών αναλυτικών διατάξεων χαρτιού και νανοϋλικών

Abstract

The aim of the PhD thesis is the development of novel analytical methods and signal readout approaches for the quantitative determination of biothiols in biological fluids which are easy to use, do not require instrumental analytical techniques and use stable and commercially available reagents which do not require specialized handling and treatment (such as those used in immunoassays or enzymatic assays). Firstly, the thesis describes a new approach for the determination of free biothiols in biological fluids that exploits some of the basic principles of early photographic chemistry — that was based on silver-halide recording materials — and uses broadly-available imaging devices (i.e. flatbed scanners) as detectors. Specifically, the proposed approach relies on the ability of biothiols to bind to silver ions and dissociate the silver halide crystals thus changing the photosensitivity of silver halide crystal suspension. The changes induced by biothiols on the light intensity transmitted through the silver halide suspension, after photochemical reduction, were measured with a simplified photometric approach that employs a flatbed scanner operating in transmittance mode. The overall analytical procedure for the determination of biothiols was easily executable, fast and could be applied with inexpensive and commercially available materials and reagents. What is more, physiologically relevant biothiol levels could be inspected even by the unattended eye. The developed assay was successfully applied to the determination of biothiols in urine and blood plasma samples with detection limits as low as 10 μM, satisfactory recoveries (92-97%), good reproducibility (6.7-8.8%) and high selectivity against other major components of biological fluids. The utility of the method to the determination of reduced/oxidized thiol ratio’s as well as its application under natural light illumination, without external energy sources, was also demonstrated and is discussed with regard to point-of need applications in facility-limited settings.In the next chapter the thesis describes the development of paper-based devices for the determination of biothiols. The devices are inexpensive (composed of paper and silver halide particles), and the analytical protocol is easily executable with minimum technical expertise and without the need of specialized equipment; the user has to add a test sample, illuminate the device with a UV lamp, and read the color change of the sensing area using a simple imaging device (i.e., cell-phone camera) or a bare eye. The detection mechanism of the assay is based on the biothiols-mediated photoreduction of nanometer-sized silver chloride particles deposited on the surface of paper; photoreduced silver chloride particles have a grayish coloration that depends on the concentration of biothiols in the tested solution. This is the first time that the UV-mediated photoreduction of solid silver halides particles is used for analytical purposes. The performance of the devices has been tested on the detection of total biothiols content of artificial body fluids and protein–free human blood plasma samples, and the results were satisfactory in terms of sensitivity, selectivity, recoveries and reproducibility. Finally, a new approach for performing analytical assays on paper-based analytical devices that relies on the principles of multiple standard additions calibration, and uses calibrant-loaded paper devices, is described. Calibrant-loaded devices have multiple sensing areas pre-loaded with an excess amount of the necessary colorimetric reagents and known amounts (standard solutions) of the tested analyte; thus, a colored product is developed before analysis in each sensing area. After sample addition, the analytical signal from each sensing area corresponds to the total concentration of the analyte, which is the sum of the concentration of the analyte in the tested sample plus the known amount of the analyte pre-stored in the device. The combined signal retrieved from each sensing zone is plotted to form a standard addition calibration curve that is used to calculate the concentration of the analyte in the sample using linear or non-linear models (i.e., first or higher order polynomials). This new approach could reduce the influence of matrix effects, paper inhomogeneity and environmental conditions on the results, and it could simplify the analysis as it may eliminate the steps associated with on-spot calibration that should ideally be performed using standard solutions that are prepared or transported in-situ. The utility and applicability of this approach is demonstrated as proof-of-concept on five assays (i.e., for the determination of iron, protein, hydrogen peroxide, acetic acid and carbonate ions) that use different reactions (i.e. complexation, oxidation and neutralization). This work provides a demonstration of a multiple standard addition methodology applied on calibrant-loaded paper-based analytical devices and illustrate its use as a sample-in result-out tool for point-of-use applications.

Στόχος της διδακτορικής διατριβής είναι η ανάπτυξη καινοτόμων μεθόδων ανίχνευσης και ανάγνωσης σήματος ως εργαλεία για τον ποσοτικό προσδιορισμό βιοθειολών σε βιολογικά ρευστά που να συνδυάζουν απλότητα στην χρήση, χωρίς ενόργανες τεχνικές ανάλυσης και να χρησιμοποιούν σταθερά και εμπορικά διαθέσιμα αντιδραστήρια που δεν απαιτούν ειδικές διαδικασίες παρασκευής και προετοιμασίας (όπως στην περίπτωση των ενζυματικών ή ανοσοχημικών μεθόδων).Αρχικά περιγράφεται μια νέα μέθοδος για τον προσδιορισμό των ελεύθερων βιοθειολών σε βιολογικά υγρά εκμεταλλευόμενη μερικές από τις βασικές αρχές της χημείας της πρώιμης φωτογραφίας– που βασίζονταν σε φωτογραφικά υλικά από αλογονίδια του αργύρου - και χρησιμοποιεί ευρέως διαθέσιμες συσκευές απεικόνισης (επίπεδους σαρωτές), ως ανιχνευτές. Συγκεκριμένα, η μέθοδος βασίζεται στην ικανότητα των βιοθειολών να δεσμεύον τα ιόντα αργύρου και να διασπούν τους κρυστάλλους αλογονιδίων αργύρου αλλάζοντας έτσι την φωτοευαισθησία του κρυσταλλικού αιωρήματος των αλογονιδίων αργύρου. Οι μεταβολές που προκαλούνται από τις βιοθειόλες, στην ένταση του φωτός που απορροφάται από το εναιώρημα των αλογονιδίων αργύρου μετά από τη φωτοχημική αναγωγή, καταγράφονται με μια απλοποιημένη φωτομετρική προσέγγιση χρησιμοποιώντας έναν επίπεδο σαρωτή. Η συνολική διαδικασία ανάλυσης για τον προσδιορισμό των βιοθειολών ήταν εύκολα εκτελέσιμη, γρήγορη και μπορεί να εφαρμοστεί με φθηνά υλικά και εμπορικά διαθέσιμα αντιδραστήρια χωρίς την ανάγκη σύνθεσης νέων υλικών. Επιπλέον, επιτρέπει την διάκριση μεταξύ φυσιολογικών και μη φυσιολογικών επίπεδων βιοθειολών ακόμη και με γυμνό μάτι. Η μέθοδος που αναπτύξαμε εφαρμόστηκε με επιτυχία στον προσδιορισμό βιοθειολών σε δείγματα ούρων και πλάσματος αίματος με όρια ανίχνευσης 10μΜ, ικανοποιητικές ανακτήσεις (92-97%), καλή επαναληψιμότητα (6.7-8.8%) και υψηλή εκλεκτικότητα έναντι άλλων συστατικών των βιολογικών υγρών. Αποδείχθηκε επίσης η χρησιμότητα της μεθόδου για τον προσδιορισμό της αναλογίας ανηγμένων/οξειδωμένων βιοθειολών καθώς και η εφαρμογή της υπό φυσικό φωτισμό, χωρίς εξωτερικές πηγές ενέργειας. Αποδεικνύεται έτσι η δυνατότητα χρήσης της μεθόδου για εφαρμογές στο σημείο χρήσης ή σε εγκαταστάσεις με περιορισμένες δυνατότητες πραγματοποίησης βιοχημικών αναλύσεων (π.χ. αγροτικά ιατρεία).Στη συνέχεια περιγράφεται η ανάπτυξη μικροαναλυτικών διατάξεων χάρτου για τον προσδιορισμό βιοθειολών. Οι διατάξεις που κατασκευάστηκαν είναι φθηνές (καθώς αποτελούνται μόνο από χαρτί και δυσδιάλυτα άλατα αλογονιδίων αργύρου) και η αναλυτική πορεία είναι εύκολα εκτελέσιμη με ελάχιστη τεχνική εμπειρογνωμοσύνη και χωρίς την ανάγκη εξειδικευμένου εξοπλισμού. Ο χρήστης πρσθέτει το εξεταζόμενο δείγμα στην διάταξη, ακτιβοβολεί την περιοχή ανίχενυσης με ακτινοβολία UV και καταγράφει την αλλαγή χρώματος της περιοχής ανίχνευσης χρησιμοποιώντας μια απλή διάταξη απεικόνισης (όπως κάμερα κινητού τηλεφώνου) ή δια γυμνού οφθαλμού. Ο μηχανισμός ανίχνευσης των βιοθειολών βασίζεται στην φωτοδιέγερση που προκαλούν οι βιοθειόλες στους νανοκρυτάλλους χλωριούχου αργύρου που έχουν εναποτεθεί στην επιφάνεια του χαρτιού. Τα φωτοανηγμένα σωματίδια χλωριούχου αργύρου έχουν γκριζωπό χρώμα η ένταης του οποίου που εξαρτάται από τη συγκέντρωση των βιοθειολών στο εξεταζόμενο διάλυμα. Οι διατάξεις δοκιμάστηκαν για την ανίχνευση της συνολικής συγκέντρωσης των βιοθειολών σε δείγματα τεχνητών βιολογικών υγρών καθως και πλάσματος ανθρώπινου αίματος και τα αποτελέσματα ήταν ικανοποιητικά όσον αφορά την ευαισθησία, την εκλεκτικότητα, τις ανακτήσεις και την επαναληψιμότητα.Τέλος, περιγράφεται μια νέα προσέγγιση για την υλοποίηση ποσοτικών αναλύσεων σε αναλυτικές διατάξεις χάρτου. Η καινοτομία της προσέγγισης βασίζεται στην ενσωμάτωση των αρχών της μεθόδου βαθμονόμησης σταθερής προσθήκης πολλαπλών σημείων σε διατάξεις χάρτου. Συγκεκριμένα, πριν την ανάλυση ενός αγνώστου δείγματος οι περιοχές ανίχνευσης τροποποιούνται με την προσθήκη των αναγκαίων χρωματομετρικών αντιδραστηρίων και γνωστές ποσότητες (πρότυπα διαλύματα) του αναλύτη. Με τον τρόπο αυτό σχηματίζεται ένα έγχρωμο προϊόν σε κάθε περιοχή ανίχνευσης. Μετά την προσθήκη του δείγματος, το αναλυτικό σήμα από κάθε περιοχή ανίχνευσης αντιστοιχεί στη συνολική συγκέντρωση του αναλύτη, η οποία είναι το άθροισμα της συγκέντρωσης του αναλύτη στο εξεταζόμενο δείγμα συν τη γνωστή ποσότητα του αναλύτη που έχει προστεθεί προηγουμένως στη διάταξη. Το συνολικό αναλυτικό σήμα που ανακτάται από κάθε ζώνη ανίχνευσης χρησιμοποιείται για την κατασκευή μιας καμπύλης βαθμονόμησης σταθερής προσθήκης από την οποία υπολογίζεται η συγκέντρωση του αναλύτη στο άγνωστο δείγμα χρησιμοποιώντας γραμμικά ή μη γραμμικά μοντέλα (δηλ., πολυώνυμα πρώτης και υψηλότερης τάξης). Αυτή η νέα προσέγγιση απλοποιεί την ανάλυση καθώς δεν απαιτείται η επί τόπου βαθμονόμηση της μεθόδου, η οποία συνήθως πραγματοποιείται με την ανάλυση πρότυπων διαλυμάτων που πρέπει να προετοιμαστούν ή να μεταφερθούν επί τόπου. Παράλληλα, μειώνει την επίδραση παρεμποδίσεων από τη μήτρα του υποστρώματος του δείγματος, από την ανομοιογένεια του χάρτου και από τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Η μέθοδος αυτή αναπτύχτηκε αρχικά με σκοπό την ανάλυση βιοθειολών όμως θεωρήθηκε σκόπιμη η περαιτέρω μελέτη και διερεύνηση των δυνατοτήτων αλλά και των περιορισμών της, χρησιμοποιώντας, μεθόδους που βασίζονται σε διαφορετικές αντιδράσεις και μηχανισμούς. Για τον λόγο αυτό εξετάστηκε (πλέον της ανάλυσης βιοθειολών με χρήση της φωτοχημικής αναγωγής αλογονιδίων το αργύρου) και σε πέντε μεθόδους (για τον προσδιορισμό σιδήρου, πρωτεϊνών, υπεροξειδίου του υδρογόνου, οξικού οξέος και ανθρακικών) οι οποίες βασίζονται σε αντιδράσεις συμπλοκοποίησης, οξείδωσης και εξουδετέρωσης. Με τον τρόπο αυτό αναδείχθηκαν όλες οι πτυχές της μεθόδου η οποία αποτελεί την πρώτη εφαρμογή της μεθόδου πολλαπλής σταθερής προσθήκης ειδικά σχεδιασμένης για αναλυτικές διατάξεις χάρτου και αναδεικνύει τη χρήση της για εφαρμογές στο σημείο χρήσης.