In silico και in vivo ανάλυση της αντιγραφής και επιδιόρθωσης του DNA

Abstract

DNA replication is a fundamental cellular process through which the cells propagate their genetic information. In eukaryotes, replication initiates from hundreds of sites scattered across the genome called origins of replication. This process takes place during S phase of the cell cycle and is tightly regulated in both time and space in order to ensure precise duplication of the entire genome within this limited time frame. Deregulation of the initiation process results in multiple rounds of replication, called re-replication which is closely connected to genomic instability.It has been shown that in Schizosaccharomyces pombe overexpression of the licensing factor Cdc18/Cdc6 is adequate to promote uneven re-replication. This means that the copy number across the genome is not the same and that certain regions appear to be significantly over-replicated. Deregulation of the licensing process can also lead to re-replication in mammalian cells thus promoting tumorigenesis. DNA damage that occurs during re-replication triggers checkpoint activation resulting in pausing the cell cycle progression and activation DNA damage repair pathways. The repair of DNA damage that is caused be re-replication is considered to result in amplification of the re-replicated regions. Gene amplification is a common form of genomic instability in cancer. It is implicated in activation of oncogenes and in drug resistance.This study focuses on investigating the molecular mechanism that leads to DNA re-replication, as well as the heterogeneity of the phenomenon in S.pombe. Moreover, we aimed to study the correlation between re-replication and gene amplification in samples from cancer patients, as well as reveal a potential implication of DNA damage response and repair pathways in this process.

Η αντιγραφή του DNA αποτελεί μια από τις θεμελιώδεις διεργασίες του κυττάρου μέσω της οποίας τα κύτταρα εξασφαλίζουν τη μεταβίβαση της γενετικής πληροφορίας στους απογόνους τους. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα η εκκίνηση της αντιγραφής συμβαίνει σε πολλαπλά σημεία διάσπαρτα στο γονιδίωμα που ονομάζονται θέσεις έναρξης της αντιγραφής. Η διαδικασία λαμβάνει χώρα κατά τη φάση S του κυτταρικού κύκλου και υπόκειται σε αυστηρή χωρική και χρονική ρύθμιση έτσι ώστε να επιτευχθεί ο πιστός και πλήρης διπλασιασμός ολόκληρου του γονιδιώματος μέσα στα χρονικά περιθώρια της φάσης S. Απώλεια της ρύθμισης της αντιγραφής οδηγεί σε επαναντιγραφή του DNA και γονιδιωματική αστάθεια.Στον Schizosaccharomyces pombe η υπερέκφραση του αδειοδοτικού παράγοντα Cdc18/Cdc6 είναι ικανή για την επαγωγή επαναντιγραφής του DNA. Η επαναντιγραφή που παρατηρείται δεν είναι ομοιόμορφη κατά μήκος των χρωμοσωμάτων, αντιθέτως συγκεκριμένες περιοχές τείνουν να υπερδιπλασιάζονται. Η απορρύθμιση του μηχανισμού αδειοδότησης επαρκεί για να προκαλέσει επαναντιγραφή και σε κύτταρα θηλαστικών και έχει συσχετιστεί με την κακοήθη εξαλλαγή των κυττάρων και τη γονιδιωματική αστάθεια. Οι βλάβες που δημιουργούνται στο DNA κατά τη διαδικασία της επαναντιγραφής ενεργοποιούν ειδικά σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που έχουν ως στόχο την αναστολή του κυτταρικού κύκλου και την επαγωγή μηχανισμών επιδιόρθωσης του DNA. Έχει προταθεί ότι η επίλυση των βλαβών που δημιουργούνται κατά την επαναντιγραφή μπορεί να οδηγήσει σε γονιδιακή ενίσχυση των υπερδιπλασιασμένων περιοχών. Η γονιδιακή ενίσχυση αποτελεί μια μορφή γονιδιωματικής αστάθειας που παρατηρείται συχνά στον καρκίνο. Αποτελεί έναν βασικό μηχανισμό ενεργοποίησης ογκογονιδίων αλλά και εμφάνισης ανθεκτικότητας των κυττάρων σε αντικαρκινικά φάρμακα, συμβάλλοντας έτσι και στην επαγωγή της καρκινογένεσης αλλά και στη διατήρηση και εξέλιξη της νόσου.Στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκαν οι μοριακοί μηχανισμοί που οδηγούν στην επαναντιγραφή του DNA καθώς επίσης πραγματοποιήθηκε μελέτη της ετερογένειας του φαινομένου στον οργανισμό S.pombe. Επιπλέον, μελετήθηκε η συσχέτιση μεταξύ των φαινομένων της επαναντιγραφής και της γονιδιακής ενίσχυσης. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε με δεδομένα υψηλής απόδοσης που αφορούν σε ασθενείς με διαφόρους τύπους καρκίνου. Τέλος, διερευνήθηκε η πιθανή συσχέτιση της γονιδιακής ενίσχυσης με μονοπάτια απόκρισης στη βλάβη αλλά και με βασικά μονοπάτια επιδιόρθωσης του DNA.