Μελέτη των μηχανισμών διαταραχής κάθαρσης αποπτωτικών και νευρωτικών κυττάρων στο Σύνδρομο Sjogren

Abstract

Primary Sjögren’s syndrome (SS) is a relatively common autoimmune disorder that is primarily characterized by chronic lymphoepithelial inflammation in the exocrine glands, mainly the salivary and lachrymal glands, leading to dryness. SS may extend from disease confined to the exocrine glands (organ-specific exocrinopathy) to various extraglandular manifestations (systemic disease) and the development of non-Hodgkin’s lymphoma (usually of mucosa-associated lymphoid tissue type; MALT-NHL) in 5% of patients. Approximately one-third of patients manifest clinico-laboratory features that represent high-risk prognostic factors for lymphoma development (type-I disease; as opposed to type-II disease, i.e. without adverse prognostic factors). Although the aetiopathogenesis of the disease remains unclear, evidence indicates the contribution of both innate and adaptive immunity in inflammatory reactions. In this PhD dissertation, we sought to investigate the innate immune responses elicited by tissue injury in SS patients.Apoptosis represents a major mechanism of programmed cell death that is essential for the regulation of tissue growth and homeostasis. Normally, cells dying by apoptosis undergo specific changes that target them for rapid clearance by professional phagocytes, such as macrophages. Typically, this process leads to the active production of anti-inflammatory mediators by phagocytes and thus facilitates the “immunologically silent” removal of apoptotic cells. The prompt elimination of apoptotic cells (also termed “efferocytosis”) is a very crucial biological process, since lingering apoptotic cells eventually proceed to the state of “late apoptosis” or “secondary necrosis” wherein they may contribute to inflammatory reactions via the release of immunogenic intracellular components, including modified autoantigens and “danger signals”. In fact, apoptosis and efferocytosis act in concert to regulate various processes, such as embryogenesis, tissue homeostasis, tolerance the elimination of damaged cells, and the resolution of inflammation.The occurrence of defective efferocytosis in certain inflammatory diseases is thought to have pathogenetic significance, based on the pro-inflammatory potential of secondary necrotic cells. Among them, systemic lupus erythematosus (SLE) is regarded as the archetypical disease model where the impaired clearance of apoptotic cells by macrophages represents a possible mechanism for the development of chronic autoimmune reactions and organ damage. Given the similarities (serological, immunogenetical and clinical) between SLE and SS, the important role of apoptosis in the pathogenesis of SS and the involvement of macrophages in the development of lymphoepithelial lesions of SS, the aim of current thesis was the investigation of the ability of SS patients’ macrophages for phagocytosis of apoptotic cells and of necrotic material. Compared to healthy blood donors (HBD), approximately half of SS and SLE patients studied (but not RA) were found to manifest significantly reduced phagocytosis of apoptotic cells by blood-borne phagocytes (ApoCell-phagocytosis). We showed that this aberration owed to the high levels of antibodies against apoptotic cells, which were present in the sera of SS and SLE patients studied (but not of RA) and, as revealed in functional experiments, they were able to inhibit the normal phagocytosis of apoptotic cells. Purified serum IgG from SS and SLE patients showed direct inhibition of ApoCell-phagocytosis by healthy monocytes and this correlated linearly with the levels of antibodies against apoptotic cells in those preparations, as well as with the presence of C3 and C4 hypocomplementemia in the respective patients. Moreover, dysfunction of phagocytes may be also present in several SS and SLE patients, as evidenced by deficient capacity of differentiated MDM for phagocytosis of apoptotic cells and microbeads. Our findings indicate that, alike in SLE, impaired efferocytosis may be also a feature of pathogenetic importance for SS.Previous experimental data have suggested that SLE patients exhibit not only defective efferocytosis, but also reduced serum mediated degradation of necrotic cell debris and increased phagocytic uptake of necrotic cells. In fact, these aberrations are thought to be involved in the pathogenesis of chronic inflammatory reactions that characterize this disease. Herein, primary Sjogren's syndrome (SS) patients were investigated for the first time for the capacity of their sera to degrade secondary necrotic cell remnants (SNEC) and DNA (endonuclease DNase1 activity), as well as for uptake of SNEC by blood-borne phagocytes. Firstly, we have shown that patients with SS exhibit significantly increased amounts of nucleosomes and circulating cell-free DNA (cf-DNA) in the peripheral blood. Compared to HBD, the sera from SS and SLE patients studied (but not RA) were found to exhibit significantly impaired capacity for degradation of SNEC and deficient DNase1 activity that correlated inversely with disease activity indices of SS and SLE. The sera of SS and SLE patients (but not of RA) with decreased DNase1 activity induced significant SNEC-phagocytosis by healthy monocytes. In line with this, the inhibition of DNase1 in HBD sera by G-actin was found to lead to significantly diminished SNEC degradation and increased SNEC uptake by healthy phagocytes, supporting the important physiologic role of serum DNase1 in the prevention of SNEC-phagocytosis. Purified serum IgG preparations from SS and SLE patients manifested increased binding to SNEC and were able to enhance significantly the engulfment of SNEC by healthy phagocytes. The latter was shown to occur both directly (under serum-free conditions) and via the prevention of physiologic degradation of SNEC by serum, most likely due to their “shielding” against endonuclease digestion. In all, our data indicate that upon cell necrosis, the immune system of SS and SLE patients may be overly exposed to the necrotic debris, a fact that probably holds a key role in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune reactions observed in these disorders.Our previous data have indicated that SS patients manifest a) aberrant clearance of apoptotic cells by phagocytes and b) impaired serum DNaseI-mediated degradation of necrotic cell remnants. These aberrations were shown to be associated with the occurrence of increased amounts of circulating nucleosomes and cell-free DNA (cf-DNA) in the blood. In this context, we sought to investigate the possible occurrence of extranuclear DNA accumulations in the peripheral blood monocytes and the salivary gland tissues of SS patients, and whether such accumulation leads to the activation of the inflammasomes. Inflammasomes are a group of multimeric protein complexes that represent a major innate immune response platform, whose activation leads to the activation of caspase 1, to the production of the pro-inflammatory cytokines IL-1β and IL-18 and finally to pyroptotic cell death. Various pathogen-derived and endogenous molecules, including nucleic acids that are released following tissue injury, have been shown to induce inflammasome activation.On this basis, we herein sought to investigate the status of inflammasome activation in sera, PBMC, circulating monocytes and the minor salivary gland specimens derived from various disease severity subgroups of SS patients (including patients with mild disease, patients in high risk for lymphoma development and patients with NHL). SS-patients at high risk for lymphoma and those with established lymphoma were found to display high serum cf-DNA levels, substantial extranuclear DNA accumulations in PBMC and the salivary gland tissue, a unique NLRP3-inflammasome gene signature in the PBMC, and significantly increased IL-18 and ASC levels in serum. In these patients, the circulating monocytes manifested NLRP3 inflammasome activation and increased response to NLRP3-stimuli, whereas salivary gland-infiltrating macrophages exhibited signs of NLRP3 activation and pyroptosis. Cell-free nucleic acids isolated from patients’ sera competently primed the activation of both NLRP3- and AIM2-inflammasome in healthy monocytes.Normally, the inflammagenic accumulation of DNA is prevented by deoxyribonucleases acting in the serum (DNaseI), the cytosol (TREX1/DNaseIII) and the lysosomes (DNaseII). We showed that SS patients are characterized by decreased serum activity of DNaseI, as well as by reduced expression of DNaseII in the peripheral blood monocytes. These aberrations were inversely correlated with indices of inflammasome activation in the peripheral blood of SS patients. In addition, the DNaseII gene-silencing in healthy monocytes was found to lead to cytoplasmic DNA deposition and activation of inflammasome-related genes and of caspase1. Conclusively, severe SS is characterized by systemic NLRP3-inflammasome activation associated with widespread extranuclear accumulations of inflammagenic DNA, correlating with impaired DNA degradation. These findings can provide novel biomarkers and new therapeutic targets for the management of SS-patients with adverse outcomes.Several lines of evidence presented previously from our group indicate that the ductal salivary gland epithelial cells of SS patients have an important role in the development of systemic inflammatory reactions, as well as those seen in salivary gland (SG) tissues. Using a well-established system for the long-term cultivation of long-term cultured non-neoplastic ductal salivary gland epithelial cell lines (SGEC) and the parallel analyses of cells derived from SS patients (SS-SGEC) and those from non-SS disease controls, we have previously provided evidence of an intrinsic activation process that operates in SS epithelia. In this dissertation, we investigated the expression and function of the peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) in epithelial cells of patients with SS. PPARγ is a nuclear transcription factor that mediates important anti-inflammatory activities in epithelial cells. Herein, the comparative analysis of SG biopsies from SS patients and controls revealed constitutively reduced PPARγ protein expression in SS patients that correlated with the severity of lymphocytic infiltrations. Moreover, analysis of SGEC lines revealed that the gene and protein expression, the transcriptional activity and the anti-inflammatory function of PPARγ are constitutively reduced in the ductal epithelia of SS patients. Diminished PPARγ activity in the SGEC of SS patients, was associated with cell-autonomously activated NF-κB and IL-1β pathways, as well as the existence of severe disease manifestations. In addition, the treatment of control SGEC lines with PPARγ agonists was shown to diminish the NF-κB activation and apoptosis induced by proinflammatory agents. Overall, our findings suggest that the intracellular anti-inflammatory factor PPARγ exhibits constitutively decreased expression in the salivary gland epithelium of SS patients with severe lymphocytic infiltrates in tissues, as well as in those with the severe clinical manifestations of the disease, presumably through chronic endogenous cellular activation of NF-κB and the autocrine effect of IL-1β produced by these cells. Furthermore, the in-vitro application of PPARγ agonists and pharmacologic inhibitors of IL-1β and NF-κB to SGEC lines of SS patients was found to have significant beneficial effects, such as the restoration of PPARγ functions and the reduction of intrinsic activation of these cell lines, which may advocate the future clinical study of the above agents as therapeutic modalities for SS. Τhe above aberrations are congruent and complementary to the previously identified cell autonomous activation of ductal epithelia in SS patients. Importantly, the results of this study essentially corroborate the key proinflammatory role of the persistently-activated epithelia of SS patients not only in the pathogenesis of lymphoepithelial lesions in the salivary glands, but also in the development of severe systemic disease manifestations, including B-cell lymphoma. In this context, among other, the transcriptome analyses of SS-SGEC lines have revealed constitutive perturbations in several inflammation- and metabolism-related signaling pathways, which in fact were more pronounced in cell lines derived from patients with severe histopathologic lesions. Such cell-autonomous aberrations included the activation of inflammasome pathway, a fact corroborated by the constitutive activation of caspase-1 and high IL-1β production in SS-SGEC lines. In the last paper of this dissertation, we investigated the activation status of inflammasome in epithelial cells of SS patients, as well as the putative triggering factors. The comparative assessment of cultured ductal SGEC lines and salivary gland tissue specimens revealed the occurrence of cell-intrinsic activation of AIM2 inflammasome in the ductal salivary epithelial cells of SS patients. Furthermore, we demonstrate that AIM2 activation in these cells is instigated by excessive cytoplasmic accumulations of damaged DNA, which correlated with the deficient expression and functionality of the intracellular DNase1. Overall, our results provide a mechanistic explanation for the chronic cell autonomous activation, that characterizes salivary gland epithelial cells of patients with SS, which is probably primarily due to the excessive activation of the AIM2 inflammasome instigated by cytoplasmic accumulations of damaged DNA, which in turn are due to a deficient degradation by intracellular DNase I. These findings are likely to indicate new biomarkers for the diagnosis and monitoring of patients with SS, as well as possible new therapeutic targets for the disease.

Το πρωτοπαθές σύνδρομο Sjögren (ΣΣ) είναι ένα σχετικά συχνό αυτοάνοσο νόσημα που χαρακτηρίζεται από χρόνια φλεγμονή του επιθηλίου των εξωκρινών αδένων, κυρίως των σιελογόνων και δακρυϊκών αδένων, με αποτέλεσμα την ξηρότητα των βλεννογόνων. Το ΣΣ εμφανίζει ευρύ κλινικό φάσμα που εκτείνεται από πάθηση περιορισμένη στους εξωκρινούς αδένες (οργανοειδική εξωκρινοπάθεια), σε νόσημα με ποικίλες εξωαδενικές εκδηλώσεις (συστηματική νόσος στο 30% περίπου), έως στην ανάπτυξη μη-Hodgkin λεμφώματος (προερχόμενο συνήθως από τον λεμφικό ιστό που σχετίζεται με βλεννογόνους, τύπος MALT-NHL [Mucosa-Associated Lymphoid Tissue], στο 5% περίπου των ασθενών). Περίπου το ένα τρίτο των ασθενών παρουσιάζουν κλινικο-εργαστηριακά χαρακτηριστικά που αποτελούν προγνωστικούς παράγοντες κινδύνου ανάπτυξης λεμφώματος [ΣΣ τύπου-I, SS-I), σε αντιδιαστολή με την νόσο τύπου-II (SS-II, που δεν εμφανίζει δυσμενείς προγνωστικούς παράγοντες]. Η παθογένεια της νόσου παραμένει ασαφής, υπάρχουν ωστόσο πειραματικά δεδομένα που αναδεικνύουν τη συμβολή τόσο της έμφυτης, όσο και της προσαρμοστικής ανοσίας στις φλεγμονώδεις αντιδράσεις που χαρακτηρίζουν την πάθηση. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, μελετήσαμε την διαχείριση των προϊόντων ιστικής καταστροφής στους ασθενείς με ΣΣ που ως γνωστόν συμμετέχουν στην επαγωγή φλεγμονωδών αποκρίσεων στο πλαίσιο της έμφυτης ανοσίας. Η απόπτωση αποτελεί το βασικότερο μηχανισμό προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου και κατέχει σημαντικό ρόλο κατά την εμβρυική ανάπτυξη των ιστών, αλλά και για την διατήρηση της ομοιόστασης τους. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, τα κύτταρα που αποπίπτουν υπόκεινται σε τροποποιήσεις με στόχο την ταχεία κάθαρση τους από τα επαγγελματικά φαγοκύτταρα, όπως τα μακροφάγα. Η διαδικασία αυτή οδηγεί στην παραγωγή αντι-φλεγμονωδών παραγόντων από τα φαγοκύτταρα οδηγώντας σε μια «ανοσολογικά σιωπηρή» απομάκρυνση των αποπτωτικών κυττάρων. Η γρήγορη και αποτελεσματική αποκομιδή των αποπτωτικών κυττάρων (γνωστή και ως “εφεροκυττάρωση”) αποτελεί μια απαραίτητη βιολογική διαδικασία, καθώς τα κύτταρα που παραμένουν αποπτωτικά για μεγάλο χρονικό διάστημα προχωρούν σε κατάσταση «δευτερογενούς νέκρωσης» (όψιμη απόπτωση). Υπό αυτή τη μορφή, τα δευτερογενώς νεκρωτικά κύτταρα επάγουν φλεγμονώδεις αποκρίσεις μέσω της απελευθέρωσης ανοσογόνων ενδοκυττάριων συστατικών, συμπεριλαμβανομένων τροποποιημένων αυτοαντιγόνων και «σημάτων κινδύνου». Συνολικά, η απόπτωση και η εφεροκυττάρωση δρουν συντονισμένα για να ρυθμίσουν σύνθετες διαδικασίες, όπως η εμβρυογένεση, η ομοιοστασία των ιστών, η διατήρηση της ανοσολογικής ανοχής, η απομάκρυνση των κατεστραμμένων κυττάρων και η ρύθμιση της φλεγμονής. Στο πλαίσιο αυτό, δεδομένων των φλεγμονογόνων ιδιοτήτων των δευτερογενώς νεκρωμένων κυττάρων, η αναποτελεσματική απομάκρυνση των αποπτωτικών κυττάρων θεωρείται ότι εμπλέκεται στην παθογένεια ορισμένων παθήσεων. Μεταξύ αυτών, ο Συστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος (ΣΕΛ) αποτελεί την πρότυπη νόσο όπου η ελαττωματική αποκομιδή των αποπτωτικών κυττάρων από τα μακροφάγα πιστεύεται ότι επάγει χρόνιες αυτοάνοσες αποκρίσεις και χρόνια βλάβη των οργάνων-στόχων. Δεδομένων των ομοιοτήτων (ορολογικών, ανοσογενετικών και κλινικών) μεταξύ του ΣΕΛ και του ΣΣ, του σημαντικού ρόλου της απόπτωσης στην παθογένεση του ΣΣ και της συμμετοχής των μακροφάγων στην ανάπτυξη των λέμφο-επιθηλιακών βλαβών, ένας από τους αρχικούς στόχους της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της ικανότητας των μακροφάγων των ασθενών με ΣΣ για φαγοκυττάρωση αποπτωτικών κυττάρων αλλά και για διαχείριση νεκρωτικού υλικού. Συγκριτικές μελέτες ανέδειξαν ότι περίπου οι μισοί ασθενείς με ΣΣ ή ΣΕΛ που μελετήθηκαν (αλλά κανένας από τους ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα) παρουσίασαν ελαττωμένη ικανότητα φαγοκυττάρωσης αποπτωτικών κυττάρων από τα φαγοκύτταρα του περιφερικού αίματος. Δείξαμε ότι η διαταραχή αυτή οφείλεται σε σημαντικό βαθμό στην ανασταλτική επίδραση αυτοαντισωμάτων έναντι των αποπτωτικών κυττάρων, τα οποία ανευρέθηκαν αυξημένα στον ορών ασθενών με ΣΣ ή με ΣΕΛ και, όπως φάνηκε σε λειτουργικά πειράματα, ήταν ικανά να εμποδίζουν την φυσιολογική φαγοκυττάρωση αποπτωτικών κυττάρων. Μάλιστα, η ανασταλτική δράση του ορού αίματος των ασθενών με ΣΣ ή με ΣΕΛ ανευρέθηκε ότι εδράζεται στο κλάσμα ανοσοσφαιρίνης IgG και μάλιστα ότι συσχετίζεται γραμμικά με τα επίπεδα των αντισωμάτων έναντι των αποπτωτικών κυττάρων, καθώς και με την παρουσία υποσυμπληρωματιναιμίας C3 και C4 στους παραπάνω ασθενείς. Στην ελαττωματική φαγοκυττάρωση αποπτωτικών κυττάρων στο ΣΣ και στον ΣΕΛ δείξαμε ότι πιθανότατα συμβάλλει και η ενδογενής δυσλειτουργία των φαγοκυττάρων των ασθενών, όπως υποδεικνύεται από την μειωμένη ικανότητα των κυκλοφορούντων μονοκυττάρων, καθώς και των in-vitro διαφοροποιημένων μακροφάγων (monocyte-derived macrophages, MDM) των ασθενών για φαγοκυττάρωση μικροσφαιριδίων. Τα ευρήματα μας υποδεικνύουν ότι, κατά παρόμοιο τρόπο με τον ΣΕΛ, η ελαττωματική φαγοκυττάρωση χαρακτηρίζει το ΣΣ και πιθανότατα συμβάλλει στην παθογένεια των χρόνιων φλεγμονωδών αντιδράσεων.Προηγούμενα πειραματικά δεδομένα έχουν υποδείξει ότι οι ασθενείς με ΣΕΛ, εκτός από την ελαττωματική εφεροκυττάρωση, εμφανίζουν από την μία πλευρά ελαττωμένη αποδόμηση του υλικού των νεκρωμένων κυττάρων στον ορό του αίματος και από την άλλη πλευρά αυξημένη πρόσληψη από τα φαγοκύτταρα, γεγονότα που επίσης εμπλέκονται παθογενετικά στις χρόνιες φλεγμονώδεις αποκρίσεις που χαρακτηρίζουν αυτό το νόσημα. Στην βάση αυτή, μελετήσαμε την ορολογική ικανότητα των ορών αίματος ασθενών με ΣΣ να αποδομούν το υλικό νεκρών κυττάρων και το DNA, η οποία οφείλεται στην δραστικότητα της κυκλοφορούσας ενδονουκλεάσης DNase I. Καταρχήν δείξαμε ότι οι ασθενείς με ΣΣ εμφανίζουν σημαντικά αυξημένες ποσότητες νουκλεοσωμάτων και εξωκυττάριου DNA (cf-DNA) στο περιφερικό αίμα. Επιπλέον δείξαμε ότι συγκρινόμενοι με τους υγιείς δότες, οι οροί αίματος τόσο των ασθενών με ΣΣ, όσο και των ασθενών με ΣΕΛ (αλλά όχι αυτών με ρευματοειδή αρθρίτιδα) εμφανίζουν σημαντικά μειωμένη ικανότητα αποδόμησης νεκρωτικού υλικού και μειωμένη δραστικότητα της DNase Ι, η οποία μάλιστα σχετίζεται αντίστροφα με τους δείκτες ενεργότητας των παραπάνω νοσημάτων. Από την άλλη πλευρά, παρατηρήσαμε ότι οι ασθενείς με ΣΣ και ΣΕΛ (αλλά όχι αυτοί με ρευματοειδή αρθρίτιδα) εμφανίζουν σημαντικά αυξημένη φαγοκυττάρωση νεκρωτικού υλικού από τα μονοκύτταρα και τα κοκκιοκύτταρα του περιφερικού αίματος, γεγονός το οποίο συσχετιζόταν με την βαρύτητα των παραπάνω νοσημάτων. Είναι σημαντικό ότι οι οροί αίματος των ασθενών με ΣΣ ή με ΣΕΛ με χαμηλή ενεργότητα DNase Ι επήγαγαν την φαγοκυττάρωση νεκρωτικού υλικού από υγιή μονοκύτταρα. Σε συμφωνία με τα παραπάνω, η αναστολή της DNase Ι σε δείγματα ορού αίματος υγιών δοτών (με την προσθήκη γ-ακτίνης) οδήγησε από την μια πλευρά σε σημαντικά μειωμένη αποδόμηση του νεκρωτικού υλικού και από την άλλη πλευρά σε σημαντικά αυξημένη φαγοκυττάρωσή του από υγιή φαγοκύτταρα. Τα δεδομένα αυτά αποδεικνύουν τον σημαντικό φυσιολογικό ρόλο της DNase Ι τόσο στην αποδόμηση των εκλυόμενων προϊόντων των νεκρών κυττάρων, όσο και στον περιορισμό της πρόσληψης νεκρωτικού υλικού από τα κυκλοφορούντα φαγοκύτταρα και την επακόλουθη ενεργοποίηση τους. Επιπλέον, διαπιστώθηκε αυξημένη πρόσδεση της ολικής IgG ανοσοσφαιρίνης των ασθενών με ΣΣ και ΣΕΛ σε υλικό νεκρών κυττάρων, γεγονός το οποίο αφενός ανέστειλε σημαντικά τη φυσιολογική αποδόμηση του υλικού αυτού μετά από προσθήκη DNase Ι ή από δείγματα ορού αίματος υγιών μαρτύρων (φαινόμενο κάλυψης, shielding), και αφετέρου οδήγησε σε αυξημένη φαγοκυττάρωση του νεκρωτικού υλικού από υγιή μονοκύτταρα. Τα παραπάνω πειραματικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι μετά τη νέκρωση κυττάρων, το ανοσολογικό σύστημα των ασθενών με ΣΣ ή ΣΕΛ εκτίθεται σε σημαντικές ποσότητες υπολειμμάτων νεκρωμένων κυττάρων, γεγονός το οποίο φαίνεται ότι συμβάλλει σημαντικά στην γένεση των έντονων φλεγμονωδών αποκρίσεων που χαρακτηρίζει αυτά τα νοσήματα.Συνοπτικά, τα παραπάνω αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ασθενείς με ΣΣ εμφανίζουν α) ανώμαλη κάθαρση των αποπτωτικών κυττάρων από τα φαγοκύτταρα και β) μειωμένη αποδόμηση υπολειμμάτων νεκρωμένων κυττάρων από την DNαση I του ορού. Και οι δύο αυτές διαταραχές συνδέονται με την εμφάνιση αυξημένων ποσοτήτων νουκλεοσωμάτων και ελεύθερου εξωκυττάριου DNA (cf-DNA) στο περιφερικό αίμα. Στο πλαίσιο αυτό, στην συνέχεια μελετήσαμε κατά πόσο στους ασθενείς με ΣΣ υπάρχει συσσώρευση εξωπυρηνικού DNA στα μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος και εξωκυττάριου DNA στους σιελογόνους αδένες, καθώς και εάν αυτή η συσσώρευση οδηγεί στην ενεργοποίηση του συστήματος των φλεγμονοσωμάτων (inflammasomes) που αποτελούν κεντρικό μηχανισμό της έμφυτης ανοσίας. Τα φλεγμονοσώματα αποτελούν ομάδα πολυμοριακών πρωτεϊνικών συμπλοκών, η ενεργοποίηση των οποίων επάγει την έμφυτη ανοσιακή απόκριση, οδηγώντας στην ενεργοποίηση της κασπάσης-1 με συνέπεια την παραγωγή δραστικών μορφών των φλεγμονωδών κυτταροκινών IL-1β και IL-18, καθώς και την επαγωγή πυρόπτωσης που αποτελεί μια ιδιαίτερα φλεγμονογόνο μορφή αποπτωτικού θανάτου των κυττάρων. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα νουκλεϊκά οξέα και ποικίλα άλλα ενδογενή μόρια που ελευθερώνονται μετά την ιστική βλάβη, επάγουν την ενεργοποίηση των φλεγμονοσωμάτων, κατά παρόμοιο τρόπο με τα προϊόντα των παθογόνων μικροβίων.Με βάση αυτά τα πειραματικά δεδομένα, διερευνήσαμε τα επίπεδα ενεργοποίησης των φλεγμονοσωμάτων στον ορό, στα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος, καθώς και σε δείγματα από ελάσσονες σιελογόνους αδένες προερχόμενα από ομάδες ασθενών με ΣΣ με ποικίλης βαρύτητας νόσο. Για τον σκοπό αυτό, στην μελέτη συμπεριελήφθησαν ομάδες α) ασθενών με ήπια νόσο, β) ασθενών με παράγοντες υψηλού κινδύνου για την εμφάνιση λεμφώματος, καθώς και γ) ασθενών που είχαν ήδη εμφανίσει λέμφωμα μη-Hodgkin (λέμφωμα τύπου ΜALT-NHL). Οι ασθενείς με ΣΣ με παράγοντες υψηλού κινδύνου για την εμφάνιση λεμφώματος, καθώς και η ομάδα ασθενών που είχαν ήδη εμφανίσει λέμφωμα εξέφραζαν: α) υψηλά επίπεδα ελεύθερου κυκλοφορούντος DNA στον ορό του αίματος (cell-free DNA, cf-DNA), β) σημαντική συσσώρευση εξωπυρηνικού DNA στα περιφερικά μονοκύτταρα και στους σιελογόνους αδένες, γ) ενεργοποίηση γονιδίων σχετιζόμενων με το μονοπάτι του NLRP3 φλεγμονοσώματος στα περιφερικά μονοκύτταρα, και δ) σημαντικά αυξημένα επίπεδα της κυτταροκίνης IL-18 και της πρωτεΐνης ASC στον ορό του αίματος τους. Σε αυτούς τους ασθενείς, τα κυκλοφορούντα μονοκύτταρα εμφάνιζαν ενεργοποίηση του φλεγμονοσώματος NLRP3 και αυξημένη απόκριση σε παράγοντες που επάγουν το φλεγμονόσωμα NLRP3. Παράλληλα, στους σιελογόνους αδένες των ασθενών, τα διηθούντα μακροφάγα εμφάνιζαν επίσης σημεία ενεργοποίησης του NLRP3 και πυρόπτωση. Επιπλέον δείξαμε ότι τα νουκλεϊκά οξέα που κυκλοφορούν στο περιφερικό αίμα των ασθενών με ΣΣ έχουν ιδιαίτερα φλεγμονογόνες ιδιότητες, δεδομένου ότι είναι ικανά να πυροδοτούν την ενεργοποίηση των φλεγμονοσωμάτων NLRP3 και AIM2 σε υγιή μονοκύτταρα. Η συσσώρευση φλεγμονογόνων μορίων DNA φυσιολογικά αναστέλλεται από την δράση δεοξυριβονουκλεασών που δρουν στον ορό (DNase Ι), το κυτταρόπλασμα (TREX1/ DNase III) και τα λυσοσώματα (DNase II). Οι αναλύσεις μας επιβεβαίωσαν την ελαττωμένη δραστικότητα DNase I στον ορό του αίματος των ασθενών με ΣΣ, σε συμφωνία με τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας, ενώ επιπλέον υπέδειξαν την μειωμένη έκφραση της DNase II στα μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος τους. Μάλιστα, οι παραπάνω διαταραχές συσχετίσθηκαν αντίστροφα με ποικίλους δείκτες ενεργοποίησης του φλεγμονοσώματος στο περιφερικό αίμα των ασθενών. Επιπλέον, βρέθηκε ότι η αποσιώπηση του γονιδίου της DNase II σε υγιή μονοκύτταρα οδηγεί στην αύξηση του κυτταροπλασματικού DNA και την επαγωγή γονιδίων που σχετίζονται με την ενεργοποίηση των φλεγμονοσωμάτων και την κασπάση-1. Συμπερασματικά, η σοβαρή μορφή του συνδρόμου Sjögren χαρακτηρίζεται από συστημική ενεργοποίηση του NLRP3 φλεγμονοσώματος γεγονός που συνδέεται με την εκτεταμένη εξωπυρηνική συσσώρευση φλεγμονογόνων μορίων DNA, μη επαρκώς αποδομημένων από την δράση της DNase I στον ορό του αίματος και της DNase II στα μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος των ασθενών. Τα ευρήματα αυτά μπορούν να οδηγήσουν στην ανάδειξη νέων βιοδεικτών και νέων θεραπευτικών στόχων για το ΣΣ.Πολλαπλές προηγούμενες μελέτες από την ερευνητική μας ομάδα έχουν υποδείξει ότι τα επιθηλιακά κύτταρα των πόρων των σιελογόνων αδένων των ασθενών με ΣΣ διαδραματίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των φλεγμονωδών αποκρίσεων τόσο στους ιστούς των σιελογόνων αδένων, όσο και συστημικά. Το γεγονός αυτό έχει καλά αναδειχθεί σε συγκριτικές μελέτες ασθενών με ΣΣ και μαρτύρων (ατόμων χωρίς ΣΣ), τόσο σε ιστούς σιελογόνων αδένων, όσο και σε καλλιεργημένες μη-νεοπλασματικές σειρές επιθηλιακών κυττάρων σιελογόνων αδένων (ΕΚΣΑ, πορικού τύπου). Ειδικότερα, η (από 20ετίας περίπου) ανάπτυξη και χρησιμοποίηση μιας ειδικής και επαναλήψιμης τεχνικής στο εργαστήριο μας για την μακρόχρονη καλλιέργεια μη-νεοπλαστικών επιθηλιακών ΕΚΣΑ επέτρεψε την μελέτη της φυσιολογίας των κυττάρων αυτών, καθώς και την ανάδειξη του σημαντικού ρόλου που αυτά κατέχουν στην παθογένεια του συνδρόμου Sjögren.Στην παρούσα διατριβή, ερευνήσαμε την έκφραση και λειτουργία του υποδοχέα PPARγ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) στα επιθηλιακά κύτταρα των ασθενών με ΣΣ. Ο υποδοχέας PPARγ είναι ένας πυρηνικός μεταγραφικός παράγοντας του οποίου η ενεργοποίηση του έχει συσχετιστεί μεταξύ των άλλων με την καταστολή κυτταρικών φλεγμονωδών αποκρίσεων (αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες). Η μελέτη των ιστών σιελογόνων αδένων ανέδειξε σημαντική υποέκφραση της πρωτεΐνης PPARγ στα επιθήλια των πόρων των ασθενών, γεγονός το οποίο συσχετιζόταν με την βαρύτητα των λεμφοκυτταρικών διηθήσεων. Από την άλλη πλευρά, στις καλλιεργημένες σειρές ΕΚΣΑ των ασθενών με ΣΣ ανευρέθη σημαντικά μειωμένη ενδογενής έκφραση του γονιδίου και της πρωτεΐνης PPARγ, των γονιδίων-στόχων αυτής, καθώς επίσης και σημαντικά μειωμένη ικανότητα δέσμευσης του μορίου PPARγ στις DNA-ακολουθίες στόχους. Η μειωμένη δραστικότητα του PPARγ στις σειρές ΕΚΣΑ των ασθενών συσχετίσθηκε αιτιολογικά με την ενδογενή ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ και της αυξημένης ενδογενούς σηματοδότησης μέσω της κυτταροκίνης IL-1β, και επιπλέον συσχετίσθηκε με τις σοβαρές κλινικές εκδηλώσεις του συνδρόμου. Επιπλέον, δείξαμε ότι η in-vitro διέγερση του PPARγ (με ειδικά μόρια-αγωνιστές του υποδοχέα αυτού) σε σειρές ΕΚΣΑ μαρτύρων οδήγησε σε μειωμένη ενεργοποίηση του NF-kB και προστάτευσε από τον αποπτωτικό θάνατο που επάγεται από φλεγμονογόνους διεγέρτες. Μάλιστα, η in-vitro ενεργοποίηση του PPARγ στις σειρές ΕΚΣΑ προερχόμενες από ασθενείς με ΣΣ φάνηκε ικανή να μειώσει την ενδογενή ενεργοποίηση των κυττάρων αυτών. Μάλιστα στις σειρές αυτές, η φαρμακολογική καταστολή των μονοπατιών της IL-1β ή του NF-κΒ οδήγησε στην αποκατάσταση της έκφρασης του PPARγ. Συμπερασματικά, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι ο ενδοκυττάριος αντιφλεγμονώδης παράγοντας PPARγ εμφανίζει εγγενώς μειωμένη έκφραση στο επιθήλιο των πόρων των σιελογόνων αδένων των ασθενών με έντονες λεμφοκυτταρικές διηθήσεις στους ιστούς αυτούς και σοβαρή κλινική μορφή της νόσου, πιθανότατα μέσω της χρόνιας ενδογενούς ενεργοποίησης του NF-κΒ στα κύτταρα αυτά και της αυτοκρινούς επίδρασης της IL-1β που παράγεται. Τα αντιφλεγμονώδη αποτελέσματα των αγωνιστών του PPARγ στις in-vitro μελέτες, αλλά και των αναστολέων της IL-1β και του NF-kB υποδεικνύουν τις φαρμακευτικές αυτές ουσίες ως υποψήφιους θεραπευτικούς παράγοντες σε μελλοντικές κλινικές μελέτες του ΣΣ. Τα παραπάνω αποτελέσματά μας ουσιαστικά επιβεβαιώνουν τον κεντρικό ρόλο των ενεργοποιημένων επιθηλιακών κυττάρων των ασθενών με ΣΣ, όχι μόνο στην παθογένεση των λεμφοεπιθηλιακών βλαβών στους σιελογόνους αδένες, αλλά και στην ανάπτυξη των σοβαρών συστημικών εκδηλώσεων της νόσου, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης Β-κυτταρικού λεμφώματος. Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής, η συγκριτική ανάλυση του μεταγραφώματος σε σειρές ΕΚΣΑ από ασθενείς με ΣΣ και μάρτυρες-νόσου υπέδειξε τη διαταραχή ποικίλων μονοπατιών σηματοδότησης που σχετιζόταν με την ανάπτυξη φλεγμονής και τον μεταβολισμό, οι οποίες μάλιστα ήταν πιο έντονες σε αυτές που προέρχονται από ασθενείς με σοβαρές ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις στις βιοψίες των σιελογόνων αδένων τους. Μεταξύ άλλων, οι αναλύσεις του μεταγραφώματος ανέδειξαν την ενδογενή ενεργοποίηση του φλεγμονοσώματος στις κυτταρικές σειρές των ασθενών, γεγονός που επιβεβαιώθηκε από την ανεύρεση της ενεργοποιημένης μορφής της πρωτεΐνης κασπάσης-1 και της υψηλής αυθόρμητης παραγωγής της κυτταροκίνης IL-1β από αυτά τα κύτταρα. Στην τελευταία εργασία της παρούσας διατριβής, μελετήθηκε ο βαθμός ενεργοποίησης των φλεγμονοσωμάτων στα επιθηλιακά κύτταρα των ασθενών με ΣΣ, καθώς και οι πιθανοί μηχανισμοί ενεργοποίησής τους. Η συγκριτική ανάλυση σειρών ΕΚΣΑ και ιστικών δειγμάτων σιελογόνων αδένων ανέδειξε την ενδογενή ενεργοποίηση του φλεγμονοσώματος AIM2 στα πορικά επιθηλιακά κύτταρα των ασθενών με ΣΣ. Επιπλέον ανευρέθηκε οτι η ενεργοποίηση του φλεγμονοσώματος AIM2 στα επιθηλιακά κύτταρα συσχετιζόταν με την παρουσία έντονων κυτταροπλασματικών συσσωρεύσεων κατεστραμμένου DNA (damaged DNA), οι οποίες από την άλλη πλευρά συσχετιζόταν με ελλαττωματική έκφραση και λειτουργία της κυτταροπλασματικής DNase I στα κύτταρα των ασθενών. Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά παρέχουν μια μηχανιστική εξήγηση για την χρόνια ενδογενή ενεργοποίηση που χαρακτηρίζει τα επιθήλια των σιελογόνων αδένων των ασθενών με ΣΣ, η οποία πιθανότατα πρωτογενώς οφείλεται στην αδόκιμη ενεργοποίηση του φλεγμονοσώματος AIM2 από κυτταροπλασματικές συσσωρεύσεις κατεστραμμένου DNA, οι οποίες με την σειρά τους οφείλονται σε ελαττωματική αποδόμηση του από την ενδοκυττάρια DNase I. Μεταξύ των άλλων, τα ευρήματα αυτά πιθανότατα υποδεικνύουν νέους βιοδείκτες για την διάγνωση και παρακολούθηση των ασθενών με ΣΣ, καθώς και ενδεχόμενους νέους θεραπευτικούς στόχους για το νόσημα.