Μοριακοί δείκτες διάγνωσης, εξέλιξης και θεραπευτικής αντιμετώπισης παιδιών με αιματολογικές κακοήθειες

Abstract

This report describes a newly-designed molecular method based on the high sensitive techniques Fragment analysis and Quantitative real-time PCR that is able to scan leukemic DNA at very low levels in the blood of patients with pediatric acute lymphoblastic leukemia. Our study presents tracks of leukemic burden at diagnosis and on days 8, 15, 33 when the commonly used markers Bone marrow infiltration and Minimal Residual Disease (MRD) reduce the value (day 8) and eliminate it (days 15 and 33) giving the impression that blasts disappear from patient’s organism. Cell-free leukemic DNA can also be scanned on these days and appears to follow the same procession and behavior as nuclear leukemic DNA although at significantly lower levels.The detection of blasts on days 15 and 33, when the number of white blood cells reduces significantly, is crucial for the progression and response to chemotherapy. The analysis of the methylation status of the promoter of Rassf6 gene reveals a methyl-CpG-domain that carries methylgroups the number of which differs between two major groups of patients. Those with favorable and those with unfavorable outcome. Therefore the detection of nuclear and cell-free leukemic DNA in blood circulation of patients with acute lymphoblastic leukemia using the hypermethylated promoter of Rassf6 gene adds prognostic value to minimal residual disease status and gives hope of potential marker in ALL to become as it follows the reduce of leukemic burden and the presence or absence of blasts in blood circulation during chemotherapy and for long time afterwards.

Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν καρκινικά κύτταρα από δείγματα ασθενών με οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία παιδικού τύπου. Τα δείγματα ελήφθησαν την ημέρα 0 (πρωτοδιάγνωση) και τις ημέρες 8, 15 και 33 όταν οι ασθενείς υποβάλλονταν σε χημειοθεραπεία. Στις ημέρες αυτές μελετήθηκε το λευχαιμικό πυρηνικό DNA καθώς και το λευχαιμικό cell-free DNA και συγκεκριμένα μελετήθηκε ο υποκινητής του ογκοκατασταλτικού γονιδίου Rassf6 για τον οποίον σχεδιάστηκε ειδική μέθοδος στο Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, που περιελάμβανε αρκετές τεχνικές (πέψη, fragment analysis, quantitative real-time PCR και Sanger sequencing). Τα αποτελέσματα της μεθόδου έδειξαν την παρουσία καρκινικού DNA και τις 4 ημέρες θεραπείας, εύρημα αξιοσημείωτο καθώς τις ημέρες 15 και 33 οι δείκτες διήθηση μυελού (bone marrow infiltration) και ελάχιστη υπολειμματική νόσος (MRD) μηδενίζονται. Η ποσοτική μέτρηση του λευχαιμικού φορτίου μας δίνει πολύ υψηλές τιμές στην πρωτοδιάγνωση (ημέρα 0) οι οποίες μειώνονται ραγδαίως τις ημέρες 8, 15 και 33 όταν δηλαδή οι ασθενείς υποβάλλονται σε χημειοθεραπεία, παρά το γεγονός ότι και την ημέρα 33, καθώς και τις προηγούμενες ημέρες ανιχνεύεται λευχαιμικό φορτίο το οποίο ποσοτικοποιείται. Τέλος η κατά βάση αλληλούχιση του υποκινητή του γονιδίου Rassf6 μας αποκάλυψε την παρουσία των χημικών ομάδων του μεθυλίου (CH3) ο αριθμός των οποίων διέφερε μεταξύ των ασθενών με θετική έκβαση και των ασθενών που κατέληξαν. Οι πρώτοι ασθενείς είχαν αρκετές μεθυλομάδες, εν συγκρίσει με την δεύτερη ομάδα ασθενών, με την δυσμενή εξέλιξη, η οποία έφερε τον διπλάσιο αριθμό μεθυλίων στον υποκινητή. Εν αντιθέσει προς αυτά τα δείγματα υγιών ατόμων δεν έφεραν καμία μεθυλομάδα στον υποκινητή του συγκεκριμένου γονιδίου, κάτι που δείχνει ότι το υπό μελέτην ογκοκατασταλτικό γονίδιο μεταφράζεται συνεχώς σε πρωτεΐνη. Εν κατακλείδι θα μπορούσαμε να πούμε ότι η σχεδιασθείσα μέθοδος μας έδωσε εικόνα των λευχαιμικών κυττάρων που κυκλοφορούν στο αίμα των ασθενών τόσο ως προς την παρουσία και την ποσότητά τους όσο και ως προς το πρότυπο μεθυλίωσης τους και καταδεικνύουν το ογκοκατασταλτικό γονίδιο Rassf6 ως πιθανό μοριακό δείκτη στην οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία παιδικού τύπου.