Ιός του Δυτικού Νείλου: μελέτη των εξελικτικών σχέσεων στελεχών του ιού στην Ελλάδα, αξιολόγηση διασταυρούμενης προστασίας εμβολίου σε ίππους και ανάπτυξη μοριακών και ορολογικών διαγνωστικών δοκιμών

Abstract

In the framework of the present doctoral thesis, a comprehensive study of evolutionary and phylogenetic relationships of lineage 2 West Nile virus (WNV) strains, which circulate in Greece since 2010 was carried out. Additionally, for the first time, preventive and diagnostic methods regarding lineage 2 WNV infections in horses were evaluated. A large number of biological specimens originating from animals and mosquitoes were tested. These specimens were submitted to our laboratory or were collected within the framework of research projects between 2010 and 2018. A real-time RT-PCR method, for the specific detection of lineage 2 WNV genome, was developed and subsequently applied for the virological screening of the samples. The full genome of 9 detected strains was determined by applying next generation sequencing (NGS). For this purpose, an enrichment strategy based on nested PCRs was developed. Subsequently, bioinformatics was employed for the study of the phylogeography of the European viral strains, as well as of the mechanisms that drive their evolution. In addition, it was found that the evolution of lineage 2 strains which circulate in Europe is mainly driven by random genetic drift. Also, selection pressure on these strains is mainly purifying selection, whereas positive selection, which is responsible for virus adaptation to new ecological nieces, was detected in a limited number of codons. Moreover, the presence of different strains in Greece was revealed, and the countries of their origin, as well as the time-points of their invasion, were estimated. The data obtained from these analyses are useful for the surveillance of WNV in Europe. The ability of a commercially available, heterologous inactivated vaccine to provide protection against natural infections of lineage 2 WNV strains was also studied under field conditions. In parallel, based on the assessment of the tertiary structure and antigenic epitopes of the viral envelope protein with bioinformatics, the efficacy of the vaccine against all genetic variants of the European strains was assessed. Based on the low evolution rate of the virus and the strong purifying selection which acts on the viral envelope protein, it is estimated that the vaccine will be effective over time. This study helped to raise awareness of the need to immunize horses in Greece, and the vaccine is now systematically used for their protection. Finally, changes in selected immunological and biochemical parameters in the serum of infected, as well as immunized horses were investigated. The results revealed differences between the studied animal groups, indicating the possible value of determining these parameters, in the context of laboratory diagnosis of equine WNV encephalitis.

Σκοπός της διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη των εξελικτικών σχέσεων και της φυλογεωγραφίας των στελεχών του ιού του Δυτικού Νείλου που ανήκουν στον εξελικτικό κλάδο 2 και κυκλοφορούν στην Ελλάδα από το 2010. Επιπλέον, για πρώτη φορά παγκοσμίως αξιολογήθηκαν μέσα πρόληψης και διάγνωσης της λοίμωξης από στελέχη του εξελικτικού κλάδου 2 σε ίππους. Εξετάσθηκε μεγάλος αριθμός βιολογικών υλικών από ζώα και κουνούπια, τα οποία προσκομίστηκαν στο εργαστήριό μας ή συλλέχθηκαν στο πλαίσιο ερευνητικών προγραμμάτων αξιολόγησης συστημάτων επιτήρησης του ιού, κατά τα έτη 2010-2018. Για τις ανάγκες του εργαστηριακού ελέγχου, αναπτύχθηκε πρωτόκολλο real-time RT-PCR για την ειδική ανίχνευση των στελεχών του εξελικτικού κλάδου 2. Αναπτύχθηκε, επίσης, ένα νέο πρωτόκολλο αλληλούχησης επόμενης γενιάς (NGS) που βασίζεται σε ένθετες PCR. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του πλήρους γονιδιώματος 9 ιικών στελεχών. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκαν λογισμικά βιοπληροφορικής για τη μελέτη της φυλογεωγραφίας των Ευρωπαϊκών ιικών στελεχών, καθώς και των μηχανισμών που διαμορφώνουν την εξέλιξη τους. Διαπιστώθηκε ότι η πλειονότητα των αλλαγών που παρατηρήθηκαν στο γονιδίωμα των στελεχών του εξελικτικού κλάδου 2 στην Ευρώπη είναι κυρίως αποτέλεσμα τυχαίας γενετικής παρέκκλισης. Η ασκούμενη πίεση επιλογής ήταν κυρίως εκκαθαριστική, ενώ εντοπίστηκε μικρός αριθμός κωδικονίων στα οποία ασκούνται δυνάμεις θετικής επιλογής, οι οποίες οδηγούν σε προσαρμογή του ιού. Ακόμη, διαπιστώθηκε η ύπαρξη διαφορετικών ιικών στελεχών στη χώρα μας, προσδιορίστηκαν οι χώρες προέλευσης τους, καθώς και τα χρονικά σημεία εισβολής των στελεχών σε κάθε χώρα. Τα δεδομένα που προέκυψαν από τις αναλύσεις αυτές είναι χρήσιμα για την επιτήρηση του ιού σε ολόκληρη την Ευρώπη. Επιπροσθέτως, αξιολογήθηκε επιτυχώς στο πεδίο η ικανότητα ενός ετερόλογου αδρανοποιημένου εμβολίου να παρέχει προστασία σε ίππους έναντι φυσικών λοιμώξεων από στελέχη του ιού που ανήκουν στον εξελικτικό κλάδο 2. Παράλληλα, με βάση την πρόβλεψη της τριτοταγούς δομής και των αντιγονικών επίτοπων της πρωτεΐνης Ε του ιού με λογισμικά βιοπληροφορικής, εκτιμήθηκε ότι το εμβόλιο είναι αποτελεσματικό έναντι του συνόλου των γενετικών παραλλαγών των Ευρωπαϊκών ιικών στελεχών. Με βάση τα ευρήματα του χαμηλού ρυθμού εξέλιξης του ιού και των πολύ ισχυρών δυνάμεων εκκαθαριστικής επιλογής που ασκούνται στην πρωτεΐνη Ε, εκτιμάται ότι το εμβόλιο θα είναι αποτελεσματικό σε βάθος χρόνου. Η μελέτη αυτή συνέβαλε από πολύ νωρίς στην ευαισθητοποίηση για την ανάγκη ανοσοποίησης των ίππων στη χώρα μας και το εμβόλιο χρησιμοποιείται πλέον συστηματικά για την προστασία τους. Τέλος, διερευνήθηκαν οι μεταβολές σε επιλεγμένες ανοσολογικές και βιοχημικές παραμέτρους του ορού αίματος μολυσμένων, καθώς και ανοσοποιημένων ίππων. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν διαφορές μεταξύ των ομάδων ζώων που εξετάστηκαν. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει την πιθανή αξία του προσδιορισμού των εν λόγω παραμέτρων, στο πλαίσιο της εργαστηριακής διάγνωσης ίππων με εγκεφαλίτιδα οφειλόμενη σε λοίμωξη από τον ιό του Δυτικού Νείλου.