Μελέτη του ρόλου του SERRATE στην απόκριση των φυτών έναντι βιοτικών καταπονήσεων στα φυτά Ν.benthamiana and N.tabacum

Abstract

RNA silencing has a prominent role in all eukaryotic organisms as a mechanism for regulating gene epression as well as regulating the relationship between plant - pathogens (ανασκοπήσεις, Huang et al., 2016; Ruiz-Ferrer and Voinnet, 2009). Especially, with regard to the study of the mechanism correlated with biotic stress, a number of studies have been carried out, both by us and others (Blevins et al., 2006; Dadami et al., 2013; Gomez et al., 2008; Katsarou, 2018; Katsarou et al., 2016; Minoia et al., 2014; Torchetti et al., 2016). They deal mainly with the study of the exogenous silencing pathway post virus and viroid infections and the mechanisms governing their relations. There have been identified factors that have a positive role in plant defense but also factors that have a positive effect on pathogen prevalence.Similar studies have been conducted also around the edogenous mechanism of RNA silencing and are related to the effect of specific miRNAs on the control or dominance of the pathogen, focusing mainly on viral and bacterial infections (ανασκόπηση, Liu et al., 2017; Navarro et al., 2006; Niu et al., 2016; Zhang et al., 2011). In the case of viroids in particular, the interest is focused on the fact that viroids themselves, due to their structural characteristics, seem to act as pri-miRNA and the produced vdsiRNAs, may function similar to miRNAs, regulating the expression of endogenous genes and thus defining the ideal conditions for their prevalence (Landry and Perreault, 2005; Markarian et al., 2004; Wang et al., 2004). It is even more interesting to refer to viroids as they have the specific capacity while inducing and are targeted by RNA silencing (Itaya et al., 2001; Papaefthimiou et al., 2001; Tabler and Tsagris, 2004) however, they manage to escape their own degradation, possibly due to their secondary structure (Itaya et al., 2007) or due to their location (Qi and Ding, 2003).By combining the information already available, we wanted to study more closely the correlation between the miRNA pathway and biotic stress. The biotic stress factore used were mainly viroids (Potato spindle tuber viroid, PSTVd and Hop stunt viroid, HSVd) and secondary a virus (Cucumber mosaic virus, CMV) and a bacterium (Pseudomonas syringae, P.syringae). For this purpose, plants with reduced functionality of the miRNA pathway were used and their effect on the infectivity of the above pathogens was studied. From a previous work in our lab, we have already generated plants, through RNAi, that suppress the primary regulator of the miRNA pathway, Dicer-like 1 (DCL1) (Dadami et al., 2013). New infections with PSTVd were made in DCL1i plants and the results were taken into account with the previous ones (Dadami et al., 2013). However, we have been unable to generate viable plants with very strong DCL1 suppression, we have generated transgenic N.benthamiana and N.tabacum plants, which suppress an equally important regulator of the miRNA pathway, the SERRATE (SE) gene. Once functional SE suppressive lines of both plant species have been characterized, we performed infectivity experiments with PSTVd, HSVd, CMV and P.syringae plant pathogens. Regarding PSTVd, both the effect of reduced SE expression on its infectivity and the effect of viroid on SE expression were studied. It was found that there is a particularly strong positive correlation between SE and PSTVd, which in conditions of strong SE suppression may even fail to infect the plants. There were indications for less intense positive correlation regarding the effect of SE on CMV infectivity, while till now, the infectivity of the bacterium P.syringae is negatively affected by SE. However, additional experimental procedures are required to confirm the results in the case of viruses and bacteria infectivity in SE suppressed conditions.

Η RNA σίγηση έχει εξέχοντα ρόλο στο σύνολο των ευκαρυωτικών οργανισμών ως μηχανισμός ρύθμισης των γονιδίων καθώς και ως ρυθμιστής της σχέσης μεταξύ φυτών – παθογόνων (ανασκοπήσεις, Huang et al., 2016; Ruiz-Ferrer and Voinnet, 2009). Ειδικότερα όσον αφορά στη μελέτη του μηχανισμού συναρτήσει βιοτικών καταπονήσεων, έχουν πραγματοποιηθεί πλήθος ερευνών, τόσο από το εργαστήριο μας όσο και από άλλους (Blevins et al., 2006; Dadami et al., 2013; Gomez et al., 2008; Katsarou, 2018; Katsarou et al., 2016; Minoia et al., 2014; Torchetti et al., 2016). Οι μελέτες αυτές πραγματεύονται κυρίως τη μελέτη που αφορά στην απόκριση σε εξωγενή RNA είτε ως αποτέλεσμα μολύνσεων με ιούς και ιοειδή, είτε ως έκφραση διαγονιδίων καθώς και των μηχανισμών που διέπουν τις μεταξύ τους σχέσεις. Έχουν εντοπιστεί παράγοντες του μηχανισμού της σίγησης που έχουν θετικό ρόλο στην άμυνα των φυτών αλλά και παράγοντες που έχουν θετική επίδραση στην επικράτηση του παθογόνου.Αντίστοιχες έρευνες έχουν πραγματοποιηθεί γύρω από τον ενδογενή μηχανισμό της RNA σίγησης και σχετίζονται με την επίδραση συγκεκριμένων miRNAs στην καταπολέμηση ή την υπεροχή του παθογόνου, δίνοντας έμφαση κυρίως σε μολύνσεις με ιούς και βακτήρια (ανασκόπηση, Liu et al., 2017; Navarro et al., 2006; Niu et al., 2016; Zhang et al., 2011). Στην περίπτωση των ιοειδών ειδικότερα, το ενδιαφέρον εστιάζεται στο γεγονός ότι τα ίδια τα ιοειδή, εξαιτίας των δομικών χαρακτηριστικών τους, φαίνεται να συμπεριφέρονται ως pri-miRNA και τα παραγόμενα vdsiRNAs,να έχουν δράση όμοια με εκείνη των miRNAs, ρυθμίζοντας την έκφραση ενδογενών γονιδίων και καθορίζοντας με αυτόν τον τρόπο τις ιδανικές για την επικράτησή τους συνθήκες (Landry and Perreault, 2005; Markarian et al., 2004; Wang et al., 2004). Ακόμα μεγαλύτερο είναι το ενδιαφέρον σχετικά με την κατηγορία των ιοειδών καθώς τα ίδια έχουν την ιδιαίτερη ικανότητα ενώ, επάγουν και αποτελούν στόχο της RNA σίγησης (Itaya et al., 2001; Papaefthimiou et al., 2001; Tabler and Tsagris, 2004), ωστόσο, καταφέρνουν να του διαφεύγουν, πιθανά λόγω της δευτεροταγούς δομής τους (Itaya et al., 2007) είτε λόγω του εντοπισμού τους (Qi and Ding, 2003).Συνδυάζοντας συνεπώς την ήδη διαθέσιμη πληροφορία, θελήσαμε να εμβαθύνουμε στην μελέτη της συσχέτισης μεταξύ του miRNA μονοπατιού της σίγησης και βιοτικής καταπόνησης. Οι βιοτικοί παράγοντες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν, κυρίως ιοειδή (Potato spindle tuber viroid, PSTVd και Hop stunt viroid, HSVd) και δευτερευόντως ένας ιός (Cucumber mosaic virus,CMV) και ένα βακτήριο (Pseudomonas syringae,P.syringae). Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν φυτά με μειωμένη λειτουργικότητα του μονοπατιού της σίγησης και μελετήθηκε η επίδρασή τους στη μολυσματικότητα των παραπάνω παθογόνων. Από προηγούμενη δουλειά στο εργαστήριό μας είχαν ήδη δημιουργηθεί, μέσω RNAi, φυτά που καταστέλλουν τον κύριο ρυθμιστή του miRNA μονοπατιού, που είναι η Dicer – like 1 (DCL1) (Dadami et al., 2013). Πραγματοποιήθηκαν νέες μολύνσεις με το PSTVd στο υπόβαθρό αυτών των φυτών και τα αποτελέσματα συνεκτιμήθηκαν με τα προηγούμενά (Dadami et al., 2013). Καθώς όμως δεν καθίσταται δυνατή η ισχυρή καταστολή του εν λόγω γονιδίου, προχωρήσαμε στη δημιουργία νέων διαγονιδιακών φυτών Nicotiana benthamiana και Nicotiana tabacum, τα οποία κατέστειλαν έναν εξίσου σημαντικό ρυθμιστή του μονοπατιού, το γονίδιο SERRATE (SE). Αφού χαρακτηρίστηκαν και επιλέχθηκαν λειτουργικές σειρές καταστολής του SE και από τα δύο είδη φυτών, προχωρήσαμε σε πειράματα μολυσματικότητας με τα φυτικά παθογόνα PSTVd, HSVd, CMV και P.syringae. Όσον αφορά στο PSTVd, μελετήθηκε τόσο η επίδραση της μειωμένης έκφρασης του SE στη μολυσματικότητα του, όσο και η επίδραση του ιοειδούς στην έκφραση του SE. Διαπιστώθηκε ότι υπάρχει μία ιδιαίτερα έντονη θετική συσχέτιση μεταξύ του SE και του PSTVd, το οποίο σε συνθήκες ισχυρής καταστολής του SE μπορεί ακόμα και να μην καταφέρει να μολύνει τα φυτά. Ενδείξεις για λιγότερο έντονη θετική συσχέτιση έδειξαν τα αποτέλεσμα που αφορούν στην μολυσματικότητα του ιού CMV, ενώ σύμφωνα με τα έως τώρα δεδομένα, αρνητική είναι η επίδραση του SE στην μολυσματικότητα του βακτηρίου P.syringae. Απαιτούνται όμως επιπλέον πειραματικές διαδικασίες για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων στην περίπτωση των ιών και των βακτηρίων.