Ο ρόλος των ενδιάμεσων νευρώνων του νωτιαίου μυελού σε κινητικές λειτουργίες: αναπτυξιακές και λειτουργικές προσεγγίσεις σε πειραματικά μοντέλα μυών

Abstract

One of the most striking features of the Vertebrate Central Nervous System (CNS) is the amazing diversity of its cell types. Identifying the responsible molecular mechanisms for neuronal diversity and understanding how they connect to each other, in order to produce accurate behaviors, still needs further investigation. The present study focused on one small interneuron population in the spinal cord, which is molecularly characterized by the expression of Pitx2 transcription factor. Although small, this population is further subdivided into two subsets: the cholinergic (V0c) and the glutamatergic (V0g). V0c interneurons comprise the source of C bouton synapses (a type of cholinergic synapse) on motor neurons. The primary objective of this work was to study the developmental events that lead to the differentiation of Pitx2+ interneurons from the parental V0 population. By using 5'-bromodeoxyuridine (BrdU) labeling, we determined that Pitx2+ neurons become post-mitotic over a wide period of time and not at a specific time window during the differentiation period of V0 neurons. We also attempted to study whether Notch signaling and Hox factors are involved in the acquisition process of Pitx2+ identity. Inactivation of the Notch signaling pathway was not found to affect the number of Pitx2+ differentiated neurons and probably is not actively involved in their differentiation process. In the experiments of this work, studying the involvement of Hox factors was not feasible. We couldn’t detect any Hox accessory factor in Pitx2+ neurons in order to deactivate it and stop the Hox signaling pathway, to study their role in the differentiation of Pitx2+ neurons.The second and most important objective of this work was to examine whether Pitx2+ neurons express a second neurotransmitter, other than acetylcholine, in the synapse. Cart neuropeptide had been previously detected in the somata of almost all V0c interneurons (> 95%) and we detected it also in their C bouton synapses on motor neurons, therefore it was recognized as a second neurotransmitter of the V0c neurons. In animals in which cholinergic neurotransmission is inhibited exclusively in V0c neurons, C bouton synapse persists on motor neurons. This was initially surprising, because a non-functional synapse is not expected to survive. The detection of Cart neuropeptide in C boutons of these animals may explain why the synapse survived. Although it contains no acetylcholine, it still contains Cart. In addition, a detailed developmental and functional study of Cart expression was carried out in the C boutons of wild-type animals. The developmental analysis showed that Cart existence in the C bouton synapse is significantly higher during the earlier and later developmental stages analyzed compared to the intermediate ones. This finding points to a possible developmental association of Cart requirement. The functional analysis revealed significantly reduced performance of mice that do not express acetylcholine or Cart in the C bouton synapse in the hanging wire test, a test that measures strength and endurance parameters. In the future, it is important to further analyse the effect of Cart on motor neurons and thus on muscles and motor behavior. Furthermore, it is important to determine whether this effect is similar to the effect of acetylcholine or not.

Ένα από τα πιο εντυπωσιακά χαρακτηριστικά του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) των σπονδυλωτών είναι η εκπληκτική ποικιλομορφία των κυτταρικών τύπων που το αποτελούν. Η κατανόηση της κυτταρικής ποικιλομορφίας, καθώς και η εξακρίβωση των μοριακών μηχανισμών που οδηγούν στην διαφορετικότητα των νευρώνων και στον τρόπο σύνδεσης μεταξύ τους ώστε να προκύψουν ακριβείς συμπεριφορές, παραμένουν πεδία με ανοιχτά ερωτήματα. Η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στη μελέτη ενός από τους μικρούς υποπληθυσμούς διάμεσων νευρώνων του νωτιαίου μυελού, τον V0cg, που εντοπίζεται στο ενδιάμεσο-κοιλιακό τμήμα του νωτιαίου μυελού και εκφράζει τον μεταγραφικό παράγοντα Pitx2. Αν και μικρός, διαχωρίζεται περαιτέρω σε δύο υποπληθυσμούς: έναν χολινεργικό (V0c) και έναν γλουταματεργικό (V0g). Ο V0c υποπληθυσμός αποτελεί την πηγή των C bouton συνάψεων (είδος χολινεργικής σύναψης) στους κινητικούς νευρώνες. Αρχικός στόχος αυτής της εργασίας ήταν η μελέτη των αναπτυξιακών γεγονότων που οδηγούν στη διαφοροποίηση των Pitx2+ διάμεσων νευρώνων από τον προγονικό πληθυσμό V0. Μέσω της σήμανσης με 5’-βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdU), προσδιορίστηκε ότι οι Pitx2+ νευρώνες γίνονται μετα-μιτωτικοί σε ένα ευρύ χρονικό διάστημα και όχι σε ένα συγκεκριμένο χρονικό παράθυρο κατά την περίοδο που οι V0 νευρώνες διαφοροποιούνται. Έγινε, επίσης, μία προσπάθεια να μελετηθεί αν η σηματοδότηση Notch και οι Hox παράγοντες εμπλέκονται στη διαδικασία απόκτησης ταυτότητας των Pitx2+ διάμεσων νευρώνων. Η απενεργοποίηση του Notch σηματοδοτικού μονοπατιού δεν βρέθηκε να επηρεάζει τον αριθμό των Pitx2+ νευρώνων που διαφοροποιούνται και, επομένως, δεν βρέθηκε να εμπλέκεται ενεργά στη διαδικασία διαφοροποίησής τους. Στα πλαίσια των πειραμάτων της συγκεκριμένης εργασίας η μελέτη της εμπλοκής των Hox παραγόντων δεν κατέστη δυνατή, καθώς δεν βρέθηκε κάποιος βοηθητικός συμπαράγοντας των Hox στους Pitx2+ νευρώνες, ώστε αυτός να απενεργοποιηθεί και εν συνεχεία να σταματήσει το σηματοδοτικό μονοπάτι των Hox και να μελετηθεί ο ρόλος τους στη διαφοροποίηση των Pitx2+ νευρώνων.Ο δεύτερος και σημαντικότερος στόχος αυτής της εργασίας ήταν να εξεταστεί αν οι Pitx2+ νευρώνες εκφράζουν κάποιον δεύτερο νευροδιαβιβαστή, εκτός από την ακετυλοχολίνη, στη σύναψη. Το νευροπεπτίδιο Cart είχε εντοπιστεί στο σώμα σχεδόν όλων των V0c νευρώνων (>95%) και τώρα εντοπίστηκε και στις C bouton συνάψεις τους πάνω στους κινητικούς νευρώνες, επομένως αναγνωρίστηκε ως ένας δεύτερος νευροδιαβιβαστής των V0c νευρώνων. Σε ζώα που παρεμποδίζεται η χολινεργική νευροδιαβίβαση αποκλειστικά στους V0c νευρώνες, η σύναψη C bouton παραμένει στους κινητικούς νευρώνες, γεγονός που αρχικά προκάλεσε έκπληξη, διότι μία μη λειτουργική σύναψη δεν αναμένεται να επιβιώσει. Η ανίχνευση του Cart νευροπεπτιδίου στη C bouton σύναψη σε αυτά τα ζώα, παρά την απουσία της ακετυλοχολίνης, ίσως εξηγεί γιατί η σύναψη επιβίωσε, καθώς παρότι δεν περιέχει ακετυλοχολίνη, περιέχει Cart. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε μία λεπτομερής αναπτυξιακή και λειτουργική προσέγγιση της έκφρασης του Cart στα C boutons αγρίου τύπου ζώων. Η αναπτυξιακή ανάλυση ανέδειξε αυξημένο εντοπισμό του στα C boutons στα πιο πρώιμα και τα πιο μεταγενέστερα αναπτυξιακά στάδια συγκριτικά με τα ενδιάμεσα στάδια που μελετήθηκαν, υποδεικνύοντας έναν ενδεχόμενο συσχετισμό του με την ανάπτυξη. Κατά τη λειτουργική προσέγγιση, τα ποντίκια που δεν εκφράζουν ακετυλοχολίνη ή Cart στη C bouton σύναψη παρουσίασαν σημαντικά μειωμένη απόδοση στη δοκιμασία του κρεμάμενου σύρματος, μία δοκιμασία που μετρά παραμέτρους σχετικές με τη δύναμη και την αντοχή. Μελλοντικά, είναι σημαντικό να προσδιοριστεί περαιτέρω η δράση που έχει το Cart στους κινητικούς νευρώνες και κατ’επέκταση στον μυ και στην κινητική συμπεριφορά, και αν αυτή η δράση είναι παρόμοια ή διαφορετική από αυτή της ακετυλοχολίνης.