Design and Synthesis of Inflammasome Inhibitors with potential cardioprotective activity

Abstract

Cardiovascular disease (CVD) is one of the main global death causes, initiated by numerous factors, including atherosclerosis and vascular inflammation. The interconnection of CVD and inflammation is becoming more evident the last decade, where the activation of a cellular pathway by various stimuli, such as alteration of the extracellular ATP concentration, leads to the formation of a multiprotein complex, the inflammasome, and ultimately to the secretion of the cytokine IL-1β. IL-1β is a key modulator of vascular inflammation and may accelerate the atherosclerotic process. In this thesis, we focused on the inhibition of the inflammasome complex, targeting two steps of the inflammatory process; the membrane P2X7 purinergic receptor, which forms a macropore non-selectively permeable to cations and larger molecules, and the NLRP3 inflammasome, which regulates the IL-1β release. The potential inhibitors of the inflammatory pathway bear also NO or H2S donor groups that are proved to negatively regulate the NLRP3 inflammasome formation and may enhance the anti-inflammatory activity. Two generations of P2X7R inhibitors were designed and synthesized. The first generation included adamantane-based amides and its bioisosteres 1,2,3-triazoles. Reported literature data along with the development of a ligand-based pharmacophore model indicated structural features and substitutions of the new analogues for effective inhibition of the receptor. The second generation aimed to replace adamantane with scaffolds that could improve the blocking activity of the novel compounds. Based on derivatives that revealed a high pharmacophore fit-score, we selected the 3-fluoro-4-(trifluoromethyl)phenyl and aryl-substituted cyclohexyl moieties in place of adamantane. All the new compounds were biologically evaluated for their inhibitory activity on P2X7R through electrophysiological experiments, using Xenopus oocytes incubated with the physiological agonist of P2X7, ATP. The results on the bioactivity of the first and second generation indicated the cyclohexyl derivatives to be the most active against the formation of the P2X7 cation channel, irrespective of the substituents’ size and nature. Along with the synthesis of the second generation, crystal structures of a mammalian P2X7 receptor, the pdP2X7 (Ailuropoda melanoleuca, giant panda), which presents comparable characteristics to human P2X7, were published and allowed the construction of a homology model, in order to study the crucial interactions for effective binding to this receptor. The analogues that exhibited the highest inhibitory activity were subjected to molecular docking studies and their favorable interactions were exploited, for the improvement of the developed homotrimer model. Purine analogues were synthesized in order to examine their role on the formation of the NLRP3 inflammasome. Preliminary results of our research group have shown that 6-piperazinyl-purine derivatives, bearing a nitrate ester group, display cardioprotective and anti-inflammatory activity. Since the exact mechanism was not elucidated, the development of a series of additional purine analogues, bearing potential NO or H2S donor groups and diverse structural features, was performed in the context of this thesis to investigate their mechanism of action. The new compounds were tested for their biological activity by measuring their effect on the LPS induced IL-1β secretion levels on aortic smooth muscle cells. Preliminary results of this study have indicated purine analogues bearing nitrate ester groups and a long chain linker as moderate inhibitors of the IL-1β release. A short chain linking the nitrate ester group with the purine core did not favor the inhibition, whereas direct attachment of furoxan on piperazine increased the basal IL-1β levels. The biological assessment of the potential H2S donor analogues highlighted a purine analogue with a 6-carbon atom chain as the most potent among the investigated compounds.

Οι καρδιαγγειακές παθήσεις προκαλούνται από διάφορους παράγοντες, όπως η αθηροσκλήρωση και η αγγειακή φλεγμονή, και αποτελούν μία από τις βασικότερες αιτίες θανάτου παγκοσμίως. Ο ρόλος της φλεγμονής στις καρδιαγγειακές νόσους γίνεται πιο εμφανής τα τελευταία χρόνια, όπου η ενεργοποίηση μιας κυτταρικής οδού από ποικίλα ερεθίσματα, όπως η μεταβολή της συγκέντρωσης της εξωκυττάριας ATP, οδηγεί στο σχηματισμό ενός πολυπρωτεϊνικού συμπλέγματος, γνωστό ως φλεγμονόσωμα, και εν τέλει στην έκκριση της βιολογικά ενεργής ιντερλευκίνης-1β. Η συγκεκριμένη κυτοκίνη παίζει σημαντικό ρόλο στην αγγειακή φλεγμονή, ενώ μπορεί να επιταχύνει την αθηροσκληρωτική διαδικασία. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η αναστολή του φλεγμονοσώματος, στοχεύοντας σε δύο βασικά στάδια της φλεγμονώδους διαδικασίας˙ στον πουρινεργικό υποδοχέα Ρ2Χ7, που σχηματίζει ένα μη εκλεκτικό κανάλι, διαπερατό σε κατιόντα και μεγαλύτερα μόρια, και στο φλεγμονόσωμα NLRP3, το οποίο ρυθμίζει την έκκριση της ιντερλευκίνης-1β. Οι πιθανοί αναστολείς του φλεγμονώδους μονοπατιού φέρουν επίσης ομάδες, πιθανούς δότες μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) ή υδρόθειου (H2S), οι οποίοι έχουν αποδειχθεί ως ρυθμιστές του NLRP3 φλεγμονοσώματος ενώ είναι πιθανό να ενισχύουν την αντιφλεγμονώδη δράση. Δύο γενιές αναστολέων του Ρ2Χ7 υποδοχέα σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν. Η πρώτη γενιά περιλαμβάνει αμίδια και τα βιοϊσοστερή τους τριαζόλια, με βασικό πυρήνα το δακτύλιο του αδαμαντανίου. Υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα, καθώς και η ανάπτυξη ενός φαρμακοφόρου μοντέλου, βασιζόμενο στις δομές των ενώσεων της πρώτης γενιάς (ligand-based) ανέδειξαν τα δομικά χαρακτηριστικά που είναι απαραίτητα για την αναστολή του υποδοχέα. Η δεύτερη γενιά είχε ως στόχο την αντικατάσταση του αδαμαντανίου με δομές που θα μπορούσαν να βελτιώσουν την ανασταλτική δράση των νέων ενώσεων. Με βάση τις δομές που παρουσίασαν τον υψηλότερο βαθμό προσαρμογής στο φαρμακοφόρο μοντέλο, επιλέχθηκαν οι ομάδες 3-φθορο-4-(τριφθορομεθυλ)φαινυλο και αρυλο-υποκατεστημένο κυκλοεξάνιο ως αντικαταστάτες του αδαμαντανίου. Όλα τα ανάλογα που συντέθηκαν, αξιολογήθηκαν βιολογικά ως προς την ανασταλτική τους δράση στον Ρ2Χ7 υποδοχέα, πραγματοποιώντας ηλεκτροφυσιολογικά πειράματα με τη χρήση κυττάρων Xenopus oocytes που επωάστηκαν με το φυσιολογικό αγωνιστή του υποδοχέα, την ΑΤΡ. Τα αποτελέσματα της βιολογικής δράσης των αναλόγων της πρώτης και δεύτερης γενιάς ανέδειξαν τα κυκλοεξανικά ανάλογα ως τα πιο δραστικά κατά της ενεργοποίησης του κατιονικού Ρ2Χ7 καναλιού, ανεξάρτητα από το είδος ή το μέγεθος του υποκαταστάτη. Παράλληλα με τη σύνθεση της δεύτερης γενιάς δημοσιεύτηκε η κρυσταλλική δομή του Ρ2Χ7 υποδοχέα του γιγαντιαίου panda (Ailuropoda melanoleuca, giant panda). Η κρυσταλλική δομή αυτού του θηλαστικού παρουσιάζει συγκρίσιμα χαρακτηριστικά με τον ανθρώπινο Ρ2Χ7 υποδοχέα και η δημοσίευση του επέτρεψε τη δημιουργία ενός ομόλογου ομοτριμερούς μοντέλου, με στόχο τη μελέτη των κρίσιμων αλληλεπιδράσεων για την πρόσδεση στον υποδοχέα. Τα πλέον δραστικά ανάλογα υποβλήθηκαν σε μελέτες μοριακής δυναμικής και οι πιο ευνοϊκές αλληλεπιδράσεις χρησιμοποιήθηκαν για τη βελτιστοποίηση του ομοτριμερούς μοντέλου. Επίσης, συντέθηκαν ανάλογα πουρινών με στόχο τη μελέτη της δράσης τους στο σχηματισμό του NLRP3 φλεγμονοσώματος. Προκαταρκτικά αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας έδειξαν ότι ανάλογα 6-πιπεραζινυλο-πουρινών, που φέρουν μία ομάδα νιτρικού εστέρα παρουσιάζουν καρδιοπροστατευτική και αντιφλεγμονώδη δράση. Καθώς ο ακριβής μηχανισμός δεν έχει ακόμη εξακριβωθεί, πραγματοποιήθηκε η σύνθεση μίας σειράς επιπλέον νέων πουρινικών αναλόγων με ποικίλα δομικά χαρακτηριστικά, που φέρουν ομάδες-πιθανούς δότες ΝΟ ή H2S, για να μελετηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός δράσης τους. Oι νέες ενώσεις μελετήθηκαν ως αναστολείς της ιντερλευκίνης-1β, επαγώμενης από λιποπολυσακχαρίτες, σε κύτταρα λείου μυός της αορτής. Προκαταρκτικά αποτελέσματα αυτών των μελετών έδειξαν ότι ανάλογα πουρινών, όπου η ομάδα νιτρικού εστέρα και η πιπεραζίνη συνδέονται με μακριά αλυσίδα, δρουν ως μέτριοι αναστολείς της έκκρισης ιντερλευκίνης-1β. Η σύνδεση του νιτρικού εστέρα με την πιπεραζινυλο-πουρίνη μέσω κοντής αλυσίδας δεν ευνοεί την ανασταλτική δράση, ενώ απευθείας σύνδεση του φουραξανίου με την πιπεραζίνη οδήγησε στην αύξηση των επιπέδων της παραγώμενης ιντερλευκίνης-1β. Η βιολογική αποτίμηση των ενώσεων που φέρουν πιθανούς δότες H2S ανέδειξαν ένα ανάλογο που φέρει μία αλυσίδα 6 ατόμων άνθρακα ως την πιο δραστική ένωση μεταξύ των αναλόγων που μελετήθηκαν.