Ρυθμιστές της δυναμικής του κυτταροσκελετού ακτίνης και επιθήλιο - μεσεγχυματική μετατροπή (ΕΜΤ) στον καρκίνο του παχέος εντέρου στον άνθρωπο

Abstract

Understanding the molecular mechanisms underlying colorectal cancer (CRC) progression is of great importance since invasion and metastasis is the major cause of CRC related morbidity and mortality. Actin cytoskeleton regulates cellular functions fundamental to cancer cells such as cell proliferation and migration. Reorganization of the actin cytoskeleton conferring increased migratory capacity is also fundamental to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), a developmental program exploited by cancer cells in order to acquire the ability to invade and metastasize.Actin-filament dynamics is regulated by actin-binding proteins that control polymerization and depolymerization of actin filaments and formation of actin-based bundles and cellular protrusions (Yamaguchi et al., 2007;dos Remedios et al., 2002). Cofilin is an actin-binding protein essential for actin-filament turnover, as it depolymerizes and severs actin filaments and it is known to have an important and complex role in cancer progression. Cofilin activity is regulated by phosphorylation-dephosphorylation at Ser3. Negative regulation of cofilin by phosphorylation at Ser 3 is mediated by LIM kinases (LIMKs), namely LIMK1 and LIMK2, while reactivation is processed by Slingshot protein phosphatases (SSH). Another important regulator of actin-filament nucleation is the N-WASP an important activator of the Arp2/3 complex. LIMKs, SSH and N-WAS are implicated in lamellipodia and invadopodia formation and in directional cell migration and they also have significant role in cancer cell invasion .Overexpression of LIMKs, SSH and N-WASP has been reported in human cancer. However, only a few studies with opposing results have addressed the role of LIMKs and N-WASP in colon cancer and there is no published data, to the best of our knowledge, regarding SSH expression in human CRC.In this respect, we evaluated the expression of non-phosphorylated (active) and phosphorylated cofilin, LIMK1, LIMK2, SSH1 and N-WASP by immunohistochemistry in 143 human CRC samples in relation to clinicopathologic parameters, response of metastatic disease to chemotherapy and epithelial-mesenchymal transition (EMT) markers β-catenin, E-cadherin, ZEB and Twist. We also evaluated expression of these F-actin regulators in human colon cancer cells with acquired resistance to 5-fluorouracil (5-FU). We show that active cofilin, LIMK1, LIMK2, SSH1 and N-WASP are overexpressed in human CRC and are associated with tumor progression parameters. SSH1 is an independent predictor of lymph node metastasis by multivariate analysis. LIMK1 and SSH1 expression is also higher in non-responders to chemotherapy and SSH1 is shown by multivariate analysis to independently predict response of metastatic disease to chemotherapy. Active cofilin, LIMK1, LIMK2, SSH1 and N-WASP also correlated with the EMT markers examined. In addition, immunofluorescence analysis showed increased expression of active cofilin, LIMK1, LIMK2 and SSH1 in HT29 colon cancer cells resistant to 5-fluorouracil compared to parental HT29 cells. Our results suggest that F-actin regulators LIMK/cofilin pathway, SSH1 and N-WASP are associated with CRC progression and chemoresistance representing promising tumour biomarkers and therapeutic targets in CRC.

Η μετάσταση σε απομακρυσμένες θέσεις από την πρωτοπαθή εστία, είναι η κύρια αιτία νοσηρότητας και θνητότητας στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Η κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου έχει μεγάλη σημασία, δεδομένου ότι η απώλεια των κυτταρικών συνδέσεων και η απόκτηση μεσεγχυματικών ιδιοτήτων, όπως η αυξημένη κινητικότητα προσδίδει στα καρκινικά κύτταρα την ικανότητα να διηθούν και να δίνουν απομακρυσμένες μεταστάσεις. Αυτή η διαδικασία είναι γνωστή ως επιθήλιο μεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΤ). Το πρώτο βήμα κατά την ΕΜΤ είναι η απώλεια των κυτταρικών συνδέσεων και της πολικότητας των επιθηλιακών κυττάρων. Η απώλεια της E- κατχερίνης θεωρείται θεμελιώδες γεγονός στην EMΤ. Οι επαγωγείς της EMT, συμπεριλαμβανομένου του σηματοδοτικού μονοπατιού Wnt/β-κατενίνης και των ιντεγκρινών, ενεργοποιούν πολύπλοκες ενδοκυτταρικές οδούς που συγκλίνουν προς στην ενεργοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων όπως του Snail, της πρωτεΐνης ZEB, και της πρωτεΐνης Twist που ενεργούν ως κύριοι ρυθμιστές EMT, καταστέλλοντας την έκφραση του E-κατχερίνης και προκαλώντας την έκφραση των μεσεγχυματικών γονιδίων.Τα καρκινικά κύτταρα χρησιμοποιούν εξειδικευμένες προεξοχές της μεμβράνης όπως πόδια διήθησης για να μεταναστεύσουν και να εισβάλουν στο στρώμα του όγκου. Ο σχηματισμός αυτών των δομών απαραίτητων για την διήθηση των κυττάρων ρυθμίζεται από τον πολυμερισμό και αποπολυμερισμό της ακτίνης, ο οποίος βρίσκεται υπό τον έλεγχο πρωτεϊνών που συνδέονται με την ακτίνη. Η ρύθμιση της cofilin με φωσφορυλίωση/απόφωσφορυλίωση είναι σημαντική για τον κύκλο λειτουργίας των νημάτων ακτίνης και εμπλέκεται στον καρκίνο. Η φωσφορυλίωση της cofilin ρυθμίζεται από τις LIM κινάσες (LIMKs) και η αποφωσφορυλίωση από την Slingshot φωσφατάση (SSH). Οι LIMK και η πρωτεΐνη SSH προάγουν τον καρκίνο, την κυτταρική διήθηση και μετάσταση και αποτελούν νέους αντικαρκινικούς στόχους. Σημαντικό ρόλο στην ρύθμιση της δυναμικής του κυτταροσκελετού ακτίνης καθώς στην διήθηση και την μετάσταση του καρκίνου παίζει επίσης και ένας ακόμας ρυθμιστής η πρωτείνη N-WASP. Οι πρωτεΐνες WASP ανήκουν στους παράγοντες που επάγουν την έναρξη του πολυμερισμού της ακτίνης-NPFs τύπου Ι ενεργοποιώντας το σύμπλοκο Arp2/3. Παρά τον σημαντικό ρόλο των ρυθμιστών της δυναμικής του κυτταροσκελετού ακτίνης στην διήθηση και μετάσταση των καρκινικών κυττάρων λίγα είναι γνωστά όσον αφορά την LIMK / cofilin, την πρωτεΐνη SSH και την N-WASP στον καρκίνο του παχέος εντέρου στον άνθρωπο.Ο σκοπός της μελέτης είναι να εξετάσουμε τον ρόλο της Cofilin-Ρ-cofilin, LIMK1, LIMK2, SSHκαι Ν-WASP, σημαντικών ρυθμιστών του κυτταροσκελετού ακτίνης, στην εξέλιξη και προαγωγή του καρκίνου του παχέος εντέρου στον άνθρωπο (CRC). Για τος σκοπό αυτό, αξιολογήσαμε την έκφραση μη-φωσφορυλιωμένης (ενεργής) και φωσφορυλιωμένης cofilin, LIMK1, LIMK2, SSH1 και Ν-WASPμε ανοσοϊστοχημεία σε 143 δείγματα CRC στον άνθρωπο σε σχέση με τις κλινικοπαθολογικές παραμέτρους, την απόκριση της μεταστατικής νόσου στη χημειοθεραπεία. Εξετάσαμε επίσης και τους δείκτες (EMT) β-κατενίνη, Ε-κατχερίνη, ΖΕΒ και Twist. Δείξαμε ότι η ενεργή cofilin, οι LIMK1, LIMK2, η πρωτεΐνη SSH1 καθώς και η πρωτεΐνη N-WASP υπερεκφράζονται στο CRC στον άνθρωπο και σχετίζονται με παραμέτρους εξέλιξης των όγκων. Μάλιστα, η πρωτεΐνη SSH1 είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας λεμφαδενικής μετάστασης. Η έκφραση της LIMK1 και της πρωτεΐνης SSH1 είναι επίσης υψηλότερη σε ασθενείς που δεν ανταποκρίθηκαν στη χημειοθεραπεία ενώ η πρωτεΐνη SSH1 με βάση τα αποτελέσματα της πολυπαραγοντικής ανάλυσης αποτελεί ανεξάρτητο δείκτη πρόβλεψης κακής απόκρισης της μεταστατικής νόσου στη χημειοθεραπεία. Επιπλέον, η ανάλυση ανοσοφθορισμού έδειξε αυξημένη έκφραση της ενεργού cofilin, LIMK1, LIMK2 και SSH1 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου παχέος εντέρου ΗΤ29 ανθεκτικές σε 5-φθοροουρακίλη σε σύγκριση με τα προγονικά HT29 κύτταρα.Στην παρούσα μελέτη δείξαμε επίσης ότι δείκτες ΕΜΤ υπερεκφράζονται στον καρκίνο του παχέος εντέρου και σχετίζονται με επιθετική νόσο και αντίσταση στην χημειοθεραπεία και οι ρυθμιστές του κυτταροσκελετού ακτίνης συσχετίστηκαν επίσης με τους εξεταζόμενους δείκτες EMT.Συμπερασματικά τα ευρήματα μας εμπλέκουν σημαντικά τους ρυθμιστές του κυτταροσκελετού ακτίνης cofilin, LIMK1, LIMK2, SSH1 και N-WASP στην εξέλιξη και προαγωγή του καρκίνου του παχέος εντέρου στον άνθρωπο. Η συσχέτιση αυτών με την πρωτεΐνη ZEB, E-κατχερίνη και B-κατενίνη, υποστηρίζει ότι οι οδοί που εμπλέκονται στην επιθήλιο-μεσγχυματική μετατροπή συνεργάζονται invivo γiα να προάγουν την διήθηση και μετάσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Αν και απιατούνται περαιτέρω μελέτες οι ρυθμιστές του κυτταρσκελετού ακτίνης φαίνεται να αποτελούν υποσχόμενους βιοδείκτες και θεραπευτικούς στόχους στον καρκίνο του παχέός εντέρου στον άνθρωπο. Συνοπτικά, παρέχουμε νέα στοιχεία ότι οι ρυθμιστές της ενεργότητας του κυτταροσκελετού της ακτινικής, LIMK1, LIMK2 και SSH1 ενέχονται στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου και του ορθού, στην χημειοαντίσταση και αποτελούν πολλά υποσχόμενους νέους θεραπευτικούς στόχους στον ορθοκολικό καρκίνο.