Ανάπτυξη καινοτόμων πεπτιδικών φορέων με ιδιότητες αυτοσυναρμογής για τοπική χορήγηση φαρμάκων

Abstract

The development of local and sustained drug delivery systems is desirable when targeted and prolonged action is required at the site of application. In this manner, high concentrations of the drug are achieved locally, ensuring prolonged action, thus avoiding side-effects due to non-selective drug distribution in healthy tissues and organs and reducing the frequency of administration. These features can improve patient compliance, which is an important parameter for enhancing therapeutic efficacy. The aim of the present study has been the development of a local and sustained drug delivery system and the in vivo evaluation of its therapeutic efficacy. Amphiphilic self-assembling peptides, which have the ability to form in situ hydrogels in the presence of biological fluids, have been evaluated as drug carriers. The study focused on the evaluation of peptide hydrogels as drug carriers for two different routes of administration. The peptide hydrogels ac-(RADA)4-CONH2 and ac-(IEIK)3I-CONH2 were evaluated as systems for the ocular administration of timolol maleate, a β-blocker used in the treatment of glaucoma and were characterized for their microstructure and mechanical properties. The diffusion of timolol from the peptide hydrogels and across pig corneas was studied in vitro and ex vivo, respectively. The pharmacodynamics and pharmacokinetics of timolol maleate was evaluated in vivo after topical instillation of the peptide hydrogels in rabbits. The peptide hydrogel ac-(RADA)4-CONH2 was further evaluated as topical drug delivery system of the chemotherapeutic drugs curcumin and doxorubicin for the management of glioblastoma. The mechanical properties of the hydrogel were evaluated by rheological studies and the drug release kinetics were determined in vitro in phosphate buffered saline. The spatial localization of the active compounds in the three-dimensional network of the hydrogel was studied by confocal scanning microscopy and the efficacy of the system to inhibit cell growth was assessed in vitro in U-87 MG human glioblastoma cells. Further enhancement of the antitumor activity of the system was investigated after the simultaneous encapsulation of doxorubicin and curcumin in the peptide hydrogel and at different concentration ratios in human head and neck cancer cells. The in vivo efficacy of the composition with optimal in vitro cytotoxicity was evaluated in HSC-3 cell-xenografted SCID mice after intratumoural administration. The morphological and anatomical characteristics of the tumors were assessed by microfocus computed tomography (μCT).The results suggest the potential therapeutic utility of the ac-(RADA)4-CONH2 peptide hydrogel as a safe drug delivery system for ophthalmic administration, that is capable of enhancing timolol maleate ocular bioavailability and achieving a sustained IOP lowering effect. The results also highlight the potential utility of the ac-(RADA)4-CONH2 hydrogel as a biocompatible delivery depot for the topical administration of both water soluble and insoluble chemotherapeutic drugs, providing prolonged release of the entrapped chemotherapeuticcompounds and enhanced intracellular uptake of doxorubicin by glioblastoma tumor cells. The synergistic chemotherapeutic efficacy of the peptide hydrogel as a delivery system for the co-administration of doxorubicin and curcumin was confirmed in vitro in head and neck cancer cells by enhancing cellular apoptosis at concentrations lower than the mean inhibitory concentration of each active substance and in vivo resulting in a significant reduction in tumour size after intratumoural administration in HSC-3 xenografted SCID mice.The results of the current study confirmed the hypothesis that amphiphilic self-assembling peptides with in situ hydrogel forming properties can effectively act as topical drug delivery systems, achieving sustained drug release and satisfactory in vivo therapeutic efficacy.

Η ανάπτυξη συστημάτων τοπικής και παρατεταμένης χορήγησης φαρμάκων είναι ιδιαίτερα επιθυμητή όταν απαιτείται στοχευμένη δράση στο σημείο της εφαρμογής για μεγάλο χρονικό διάστημα. Κατά τον τρόπο αυτό επιτυγχάνονται τοπικά υψηλές συγκεντρώσεις της χορηγούμενης δραστικής ουσίας, εξασφαλίζοντας παρατεταμένη δράση με αποτέλεσμα να αποφεύγεται η εκδήλωση ανεπιθύμητων ενεργειών εξαιτίας της μη εκλεκτικής κατανομής της δραστικής ουσίας σε υγιείς ιστούς και όργανα και να μειώνεται η συχνότητα χορήγησης. Τα χαρακτηριστικά αυτά συμβάλλουν στη βελτίωση της συμμόρφωσης των ασθενών η οποία αποτελεί σημαντική παράμετρο για την επίτευξη ικανοποιητικής θεραπευτικής αποτελεσματικότητας.Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η ανάπτυξη ενός συστήματος τοπικής και παρατεταμένης χορήγησης φαρμάκων και η in vivo αξιολόγηση της θεραπευτικής του αποτελεσματικότητας. Στην παρούσα μελέτη αξιολογήθηκαν ως φορείς φαρμάκων αμφίφιλα πεπτίδια αυτοσυναρμογής τα οποία έχουν την ικανότητα να σχηματίζουν in situ υδροπηκτές παρουσία βιολογικών υγρών. Η μελέτη επικεντρώθηκε στην αξιολόγηση των πεπτιδικών υδροπηκτών ως φορέων φαρμάκων για δύο διαφορετικές οδούς χορήγησης. Οι πεπτιδικές υδροπηκτές με αλληλουχίες αμινοξέων ac-(RADA)4-CONH2 και ac-(IEIK)3I-CONH2 αξιολογήθηκαν ως συστήματα οφθαλμικής χορήγησης του μηλεϊνικού άλατος της τιμολόλης, ενός β-αποκλειστή που χρησιμοποιείται στη θεραπευτική αντιμετώπιση του γλαυκώματος και χαρακτηρίστηκαν ως προς τη μικροδομή και τις μηχανικές τους ιδιότητες. Η διάχυση της τιμολόλης από τις πεπτιδικές υδροπηκτές και διαμέσου κερατοειδούς χιτώνα που απομονώθηκε από χοίρο μελετήθηκε in vitro και ex vivo, αντίστοιχα. Η αποτελεσματικότητα και η τοξικότητα των πεπτιδικών υδροπηκτών ως φορέων της τιμολόλης αξιολογήθηκε in vivo έπειτα από τοπική ενστάλαξη σε πειραματικό μοντέλο κουνελιών με την πραγματοποίηση φαρμακοδυναμικής και φαρμακοκινητικής μελέτης καθώς και ιστολογικών μελετών. Η πεπτιδική υδροπηκτή ac-(RADA)4-CONH2 μελετήθηκε επιπλέον ως φορέας τοπικής χορήγησης των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων κουρκουμίνη και δοξορουβικίνη για τη θεραπευτική αντιμετώπιση μιας επιθετικής μορφής καρκίνου του εγκεφάλου, του γλοιοβλαστώματος. Οι μηχανικές ιδιότητες του συστήματος αξιολογήθηκαν με ρεολογικές μελέτες και η κινητική αποδέσμευσης των δραστικών ουσιών από την υδροπηκτή προσδιορίστηκε in vitro σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών. Ο χωρικός εντοπισμός των δραστικών ενώσεων στο τρισδιάστατο δίκτυο της υδροπηκτής μελετήθηκε με συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης και η αποτελεσματικότητα του συστήματος να αναστέλλει την κυτταρική ανάπτυξη αξιολογήθηκε in vitro σε ανθρώπινα κύτταρα γλοιοβλαστώματος U-87 MG. Η περαιτέρω ενίσχυση της αντικαρκινικής δράσης του συστήματος διερευνήθηκε έπειτα από τον ταυτόχρονο εγκλωβισμό της δοξορουβικίνης και της κουρκουμίνης στην πεπτιδικήυδροπηκτή και σε διαφορετικές αναλογίες συγκεντρώσεων σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου κεφαλής και τραχήλου. Η in vivo αποτελεσματικότητα της σύστασης με τη βέλτιστη in vitro κυτταροτοξική δράση αξιολογήθηκε σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια ξενιστές καρκίνου κεφαλής και τραχήλου, κατόπιν τοπικής χορήγησης στον όγκο. Τα μορφολογικά και ανατομικά χαρακτηριστικά των όγκων αξιολογήθηκαν με υπολογιστική τομογραφία μικροεστίασης (μCT).Τα αποτελέσματα της μελέτης αξιολόγησης της πεπτιδικής υδροπηκτής ως σύστημα οφθαλμικής χορήγησης της τιμολόλης υποδεικνύουν την ασφάλεια και αποτελεσματικότητα του συστήματος να ενισχύει τη βιοδιαθεσιμότητα της χορηγούμενης τιμολόλης, επιτυγχάνοντας ταυτόχρονα παρατεταμένη μείωση της ενδοφθάλμιας πίεσης. Τα αποτελέσματα της μελέτης αξιολόγησης της πεπτιδικής υδροπηκτής ως σύστημα τοπικής χορήγησης της κουρκουμίνης και της δοξορουβικίνης υποδεικνύουν την ικανότητα της υδροπηκτής να εξασφαλίζει παρατεταμένη αποδέσμευση των εγκλωβισμένων χημειοθεραπευτικών ενώσεων και ενίσχυση της ενδοκυττάριας πρόσληψης της δοξορουβικίνης από καρκινικά κύτταρα γλοιοβλαστώματος. Η συνεργιστική χημειοθεραπευτική αποτελεσματικότητα της πεπτιδικής υδροπηκτής ως συστήματος συγχορήγησης της δοξορουβικίνης και της κουρκουμίνης επιβεβαιώθηκε in vitro σε καρκινικά κύτταρα κεφαλής και τραχήλου με την ενίσχυση της κυτταρικής απόπτωσης σε συγκεντρώσεις χαμηλότερες από τη μέση ανασταλτική συγκέντρωση εκάστοτε δραστικής ουσίας και in vivo επιφέροντας σημαντική μείωση του μεγέθους των όγκων, έπειτα από τοπική χορήγηση σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια ξενιστές.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή επιβεβαιώθηκε η υπόθεση ότι αμφίφιλα πεπτίδια αυτοσυναρμογής με ικανότητα in situ σχηματισμού υδροπηκτών παρουσία βιολογικών υγρών δρουν αποτελεσματικά ως συστήματα τοπικής χορήγησης φαρμάκων εξασφαλίζοντας παρατεταμένη αποδέσμευση και ικανοποιητική θεραπευτική αποτελεσματικότητα.