Περίληψη
Η νόσος Πάρκινσον (ΝΠ) είναι η δεύτερη σε συχνότητα νευροεκφυλιστική διαταραχή και χαρακτηρίζεται από την απώλεια των ντοπαμινεργικών νευρώνων της συμπαγούς μοίρας της μέλαινας ουσίας που προβάλλουν τις απολήξεις τους στο ραβδωτό σώμα, καθώς και άλλων τύπων νευρώνων σε όλη την έκταση του εγκεφάλου. Μέχρι σήμερα δεν γνωρίζουμε αν η εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων είναι η αιτία της έναρξης της ασθένειας ή αποτελεί την αναπόφευκτη συνέπεια πολλαπλών δυσλειτουργιών στον εγκέφαλο, ωστόσο αντιπροσωπεύει ένα κοινό παθολογικό χαρακτηριστικό που ευθύνεται για πολλά από τα κλινικά συμπτώματα. Μείζον νευροπαθολογικό γνώρισμα της ΝΠ είναι η συσσώρευση ενδοκυττάριων πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων στα σώματα και τους νευρίτες των προσβεβλημένων νευρώνων, στα οποία εντοπίζεται κατά κύριο λόγο η πρωτεΐνη α-συνουκλεΐνη (αSyn). Η αSyn είναι μικρή προσυναπτική πρωτεΐνη της οποίας η φυσιολογική λειτουργία δεν έχει διαλευκανθεί επαρκώς, ωστόσο η συμμετοχή της στην παθολογία της ΝΠ είναι ευρέως αποδεκτή. ...
Η νόσος Πάρκινσον (ΝΠ) είναι η δεύτερη σε συχνότητα νευροεκφυλιστική διαταραχή και χαρακτηρίζεται από την απώλεια των ντοπαμινεργικών νευρώνων της συμπαγούς μοίρας της μέλαινας ουσίας που προβάλλουν τις απολήξεις τους στο ραβδωτό σώμα, καθώς και άλλων τύπων νευρώνων σε όλη την έκταση του εγκεφάλου. Μέχρι σήμερα δεν γνωρίζουμε αν η εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων είναι η αιτία της έναρξης της ασθένειας ή αποτελεί την αναπόφευκτη συνέπεια πολλαπλών δυσλειτουργιών στον εγκέφαλο, ωστόσο αντιπροσωπεύει ένα κοινό παθολογικό χαρακτηριστικό που ευθύνεται για πολλά από τα κλινικά συμπτώματα. Μείζον νευροπαθολογικό γνώρισμα της ΝΠ είναι η συσσώρευση ενδοκυττάριων πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων στα σώματα και τους νευρίτες των προσβεβλημένων νευρώνων, στα οποία εντοπίζεται κατά κύριο λόγο η πρωτεΐνη α-συνουκλεΐνη (αSyn). Η αSyn είναι μικρή προσυναπτική πρωτεΐνη της οποίας η φυσιολογική λειτουργία δεν έχει διαλευκανθεί επαρκώς, ωστόσο η συμμετοχή της στην παθολογία της ΝΠ είναι ευρέως αποδεκτή. Στη συντριπτική πλειοψηφία των περιπτώσεων, η νόσος είναι σποραδική και πιθανώς οφείλεται στο συνδυασμό γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων κινδύνου. Σε μια μειοψηφία περιπτώσεων (5-10%) η νόσος είναι κληρονομική με την ύπαρξη μεταλλάξεων σε συγκεκριμένα γονίδια. Το γονίδιο SNCA που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη αSyn συνδέεται με τη ΝΠ ενώ σημειακές μεταλλάξεις και διπλασιασμός ή τριπλασιασμός του γονιδιακού τόπου προκαλούν μία αυτοσωμική επικρατή μορφή της νόσου, που συχνά χαρακτηρίζεται από πρώιμη έναρξη και γενικά σοβαρό φαινότυπο. Η σημειακή μετάλλαξη αντικατάστασης G209A στο γονίδιο SNCA που συνεπάγεται τη σύνθεση της παθολογικής πρωτεΐνης p.A53T αSyn προσδιορίστηκε για πρώτη φορά σε οικογένειες ιταλικής και ελληνικής καταγωγής και αποτελεί την καλύτερα μελετημένη μετάλλαξη. Αν και η πλειοψηφία των περιπτώσεων της νόσου είναι σποραδικές, οι μελέτες σε οικογενείς μορφές που είναι κλινικά και νευροπαθολογικά παρόμοιες με τις σποραδικές συνέβαλαν σημαντικά στην κατανόηση της ΝΠ.Παρότι η ΝΠ περιγράφηκε για πρώτη φορά πριν 200 χρόνια και παρά τις έκτοτε εντατικές έρευνες σε ζωϊκά πειραματικά μοντέλα ή μεταθανάτιους ιστούς ανθρώπινου εγκεφάλου, οι αιτίες που ευθύνονται για την εμφάνιση και την εξέλιξη της νόσου παραμένουν σε μεγάλο βαθμό αδιευκρίνιστες. Ένας σημαντικός ανασταλτικός παράγοντας ήταν η έλλειψη κατάλληλων μοντέλων που προσομοιάζουν επαρκώς τα χαρακτηριστικά της ασθένειας στον άνθρωπο. Έτσι θεραπευτικές προσεγγίσεις, πολλά υποσχόμενες σε προκλινικό επίπεδο, απέτυχαν όταν έφτασαν σε κλινικές δοκιμές. Σήμερα η επαναστατική τεχνολογία του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού και η κατασκευή επαγόμενων πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων (iPSCs) από ενήλικα σωματικά κύτταρα ασθενών άνοιξαν νέες προοπτικές για την κατανόηση της ΝΠ. Οι προσεγγίσεις αυτές επιτρέπουν τη δημιουργία εξατομικευμένων κυτταρικών μοντέλων για τη μελέτη της παθογένειας και της εξέλιξης της ΝΠ και δίνουν μοναδικές ευκαιρίες για την ανακάλυψη ή επανατοποθέτηση φαρμάκων.Σε διάφορα μοντέλα που αναπτύχθηκαν την τελευταία επταετία με βάση την τεχνολογία των iPSCs από κύτταρα ασθενών και τη στοχευμένη διαφοροποίηση τους σε νευρώνες, αναδείχθηκαν φαινότυποι που σχετίζονται με τη ΝΠ, όπως αυξημένη ευαισθησία σε οξειδωτικό ή νιτρώδες στρες, μιτοχονδριακές ανωμαλίες, νευραξονική παθολογία και μειωμένη συναπτική συνδεσιμότητα. Στο Εργαστήριο Κυτταρικής και Μοριακής Νευροβιολογίας και Βλαστικών Κυττάρων του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ, αναπτύχθηκε ένα in vitro μοντέλο για οικογενή ΝΠ με χρήση iPSCs από δύο ασθενείς που φέρουν τη μεταλλαγή p.A53T-αSyn. Με κατευθυνόμενη διαφοροποίηση δημιουργήθηκε ένα κυτταρικό σύστημα που εμφανίζει νευροεκφυλιστικούς φαινοτύπους σχετιζόμενους με τη ΝΠ, όπως συσσώρευση πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων, μειωμένη συναπτική συνδεσιμότητα και παθολογία των νευραξόνων [420]. Στην παρούσα μελέτη διερευνήσαμε τους in vivo φαινοτύπους των κυττάρων αυτών μετά από μεταμόσχευση σε μοντέλο ποντικού στο οποίο είχε προκληθεί βλάβη με μονόπλευρη έγχυση 6-υδροξυντοπαμίνης (6-OHDΑ) στο ραβδωτό σώμα του εγκεφάλου ποντικών του ανοσοκατασταλμένου στελέχους NOD/SCID. Για τον σκοπό αυτό, εφαρμόσαμε ένα πρωτόκολλο επαγωγής εδαφιαίου νευρικού πετάλου σε iPSC κυτταρικές σειρές προερχόμενες από έναν p.Α53Τ ασθενή και έναν υγιή δότη προκειμένου να διαφοροποιηθούν προς τη ντοπαμινεργική γενεαλογία. Το πρωτόκολλο αυτό περιλαμβάνει μείγμα μικρών μορίων που αποτελούν είτε αναστολείς των μονοπατιών BMP/ TGF-β/ Activin είτε επαγωγείς του μονοπατιού sonic hedgehog και του μονοπατιού σηματοδότησης WNT, ακολουθούμενο από παράγοντες που ευνοούν τη στοχευμένη διαφοροποίηση σε νευρώνες. Με αυτό το πρωτόκολλο, την ημέρα 11 in vitro (11 DIV) πρακτικά όλα τα κύτταρα στην καλλιέργεια είναι θετικά για τον μεταγραφικό παράγοντα LMX1A που χαρακτηρίζει τα νευροεπιθηλιακά κύτταρα του εδαφιαίου πετάλου ενώ περίπου τα μισά είναι διπλά θετικά για τους παράγοντες LMX1A και FOXA2 που χαρακτηρίζουν τα πρόδρομα κύτταρα της ντοπαμινεργικής γενεαλογίας. Νευρώνες κατάλληλοι για μεταμόσχευση αποκτήθηκαν μετά από 25 DIV και για να αποφευχθούν φαινόμενα υπερπλασίας in vivo, εφαρμόστηκε ανοσοεμπλουτισμός σε νευρωνικά κύτταρα με τη βοήθεια μαγνητικών σφαιριδίων επικαλυμμένων με αντίσωμα έναντι PSA-NCAM κατά την ημέρα 28 DIV. Πειράματα ανοσοφθορισμού την ημέρα 30 DIV, ακριβώς κατά τον χρόνο της μεταμόσχευσης, έδειξαν ότι η καλλιέργεια απαρτιζόταν κατά 70% από ανώριμους νευρώνες θετικούς για τους μάρτυρες της πρώιμης νευρικής διαφοροποίησης διπλοκορτίνη (DCX) και βΙΙΙ-τουμπουλίνη ενώ σημαντικό ποσοστό παρέμενε θετικό για τον μάρτυρα των πρόδρομων νευρικών κυττάρων, νεστίνη. Δεν βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο καλλιεργειών.Δεδομένου ότι το πρωτόκολλο στοχευμένης διαφοροποίησης που εφαρμόστηκε στην παρούσα μελέτη διέφερε από αυτό που εφαρμόστηκε στην εργασία των Kouroupi και συνεργατών, κρίναμε σκόπιμο να διερευνήσουμε τα χαρακτηριστικά που αποκτούν οι καλλιέργειες από PD και υγιή δότη σε διάστημα μακρότερο των 30 ημερών, πριν προχωρήσουμε στη μεταμόσχευσή τους. Εξετάσαμε παραμέτρους που αφορούν στη μορφολογία και τη λειτουργικότητα των κυττάρων με ανοσοφθορισμό, ηλεκτροφυσιολογικές καταγραφές και απεικόνιση ιόντων ασβεστίου. Ανάλυση μεταξύ των ημερών 45-70 DIV έδειξε ότι τα PD κύτταρα παρουσίασαν εμφανή σημάδια εκφύλισης. Ανώριμοι PD νευρώνες θετικοί για διπλοκορτίνη (DCX) εμφάνισαν αυξημένες νευριτικές εκφύσεις και δευτερογενείς διακλαδώσεις ενώ ανιχνεύθηκε ενδοκυττάρια συσσώρευση πρωτεϊνών τόσο σε DCX-θετικούς νευρώνες όσο και σε ώριμους ντοπαμινεργικούς νευρώνες θετικούς για το ένζυμο υδροξυλάση της τυροσίνης (TH). Σε PD καλλιέργειες των 70 DIV, τα πυκνά δίκτυα των TH-θετικών νευρώνων παρουσίαζαν δυστροφικούς και κατακερματισμένους νευρίτες. Παρατηρήθηκε επίσης αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης αSyn, που αποτελεί παθολογική ένδειξη. Όσον αφορά τη λειτουργικότητα, οι ηλεκτροφυσιολογικές καταγραφές δεν έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των PD και υγιών νευρώνων στις ενεργητικές και παθητικές μεμβρανικές ιδιότητες. Η ακεραιότητα του νευρωνικού δικτύου σε PD και υγιείς καλλιέργειες αξιολογήθηκε με απεικόνιση των ιόντων ασβεστίου. Η μέθοδος φανέρωσε συχνότερες αυθόρμητες διακυμάνσεις στις συγκεντρώσεις του ενδοκυττάριου ασβεστίου στις PD καλλιέργειες σε σύγκριση με αυτές από υγιή δότη, με μεγαλύτερο μέσο εύρος διακύμανσης. Η παρατήρηση αυτή έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, δεδομένου ότι οι διακυμάνσεις των ιόντων ασβεστίου ρυθμίζουν πλήθος βιολογικών διεργασιών, μεταξύ των οποίων την αύξηση των νευριτών και τη συναπτική συνδεσιμότητα, όπου παρατηρούνται σημαντικές διαφορές μεταξύ PD και υγιών κυττάρων.Στη συνέχεια, προκειμένου να διερευνήσουμε τις ιδιότητες των PD κυττάρων in vivo μετά από μεταμόσχευση στον εγκέφαλο, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο χημικής βλάβης που αναπτύχθηκε μετά από στερεοτακτική έγχυση της τοξίνης 6-υδροξυντοπαμίνης (6-OHDA) στο ραβδωτό σώμα ποντικών του στελέχους NOD/SCID, το οποίο υποστηρίζει την επιβίωση ξενομοσχεύματος. Η 6-OHDA προκαλεί την ανάδρομη εκφύλιση των ΤΗ θετικών νευρώνων της μέλαινας ουσίας με αποτέλεσμα την εμφάνιση κινητικής δυσλειτουργίας. Δύο εβδομάδες μετά την έγχυση της τοξίνης, η συμπεριφορική ανάλυση των ποντικών επιβεβαίωσε την προκαλούμενη καταστροφή τόσο με αξιολόγηση της επαγόμενης με αμφεταμίνη στροφικής ασυμμετρίας όσο και με καταγραφή της κινητικής δραστηριότητας των προσθίων και οπισθίων άκρων χωρίς τη χορήγηση αμφεταμίνης. Ωστόσο η λειτουργική ανάλυση σε μεγαλύτερο χρόνο, έως 15 εβδομάδες μετά την πρόκληση της βλάβης, αποκάλυψε την αυθόρμητη ανάκαμψη της κινητικής συμπεριφοράς των ποντικών. Ακόμη, αν και η απώλεια των ντοπαμινεργικών νευρώνων της μέλαινας ουσίας παρέμεινε σταθερή σε ποσοστό 60% σε διάστημα 15 εβδομάδων, παρατηρήθηκε επανεύρωση του ραβδωτού σώματος, όπου προβάλλουν οι ντοπαμινεργικοί νευρώνες της μέλαινας ουσίας. Η παρατηρούμενη επανεύρωση του ραβδωτού είναι σύμφωνη με τη συμπεριφορική βελτίωση και μπορεί να εξηγηθεί με πιθανή εκβλάστηση/ ανάπτυξη των υπολειπομένων ντοπαμινεργικών απολήξεων που δεν καταστράφηκαν με τη χορήγηση 6-OHDA στο ραβδωτό ή/ και με συνεισφορά ντοπαμινεργικών ινών από το ετερόπλευρο ημισφαίριο.Για τη μελέτη των in vivo χαρακτηριστικών τους, PSA-NCAM ανοσοεμπλουτισμένες καλλιέργειες νευρικών κυττάρων τόσο από PD όσο και από υγιή δότη (30 DIV), μεταμοσχεύθηκαν 3 εβδομάδες μετά την έγχυση 6-OHDΑ στο ραβδωτό σώμα του εγκεφάλου ποντικών του στελέχους NOD/SCID. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση 12 εβδομάδες μετά τη μεταμόσχευση έδειξε ότι τα PD κύτταρα, παρά τα σχετιζόμενα με τη νόσο χαρακτηριστικά που παρουσίασαν έως και 70 DIV, επιβίωσαν και διαφοροποιήθηκαν in vivo παρόμοια με τα κύτταρα του υγιούς δότη. Ωστόσο, παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ των μοσχευμάτων. Συγκεκριμένα, διαπιστώθηκε αύξηση της πρωτεΐνης αSyn στα μοσχεύματα του ασθενούς, που αποτελεί μία πρώτη παθολογική ένδειξη. Σε συμφωνία με την παρατήρηση αυτή, φάνηκε ότι τα υγιή κύτταρα ενσωματώνονται καλύτερα στον εγκέφαλο του ξενιστή σε σύγκριση με τα PD, καθώς εξέτειναν προεκβολές που σχημάτιζαν περισσότερες συνδέσεις με τους μεσαίους ακανθώδεις νευρώνες του ραβδωτού σώματος του ξενιστή. Τέλος, τα PD κύτταρα είχαν την τάση να παραμένουν σε μία πιο αδιαφοροποίητη κατάσταση σε σύγκριση με τα υγιή. Το γεγονός αυτό πιθανά εξηγεί την περιορισμένη ικανότητά τους να σχηματίζουν συνδέσεις με τα κύτταρα του ξενιστή.Συνολικά τα αποτελέσματα της μελέτης μας δείχνουν ότι τα διακριτά χαρακτηριστικά εκφύλισης που παρουσιάζουν τα PD κύτταρα in vitro, εξασθενούν ή ενδεχομένως απαιτούν περισσότερο χρόνο για να εμφανιστούν in vivo μετά από μεταμόσχευση στον εγκέφαλο του ποντικού. Λαμβάνοντας υπόψιν το περιορισμένο ποσοστό ώριμων ντοπαμινεργικών νευρώνων στα μοσχεύματα τόσο του ασθενούς όσο και του υγιούς, είναι επιθυμητή η εξέταση των μοσχευμάτων σε μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα, άνω του εξαμήνου, προκειμένου να δοθεί ικανός χρόνος για να διαφοροποιηθούν τα ανθρώπινα κύτταρα. Αυτό αποτελεί αρκετά δύσκολο στόχο με βάση το ποσοστό θνησιμότητας των NOD/SCID ζώων μετά τη χορήγηση 6-OHDA. Μακροχρόνιες μελέτες απαιτούνται επίσης για να διαλευκανθεί αν η αύξηση της αSyn στα μοσχεύματα του ασθενούς – χαρακτηριστικό που δεν σχετίζεται με την πιο ανώριμη κατάσταση των PD κυττάρων σε σύγκριση με τα υγιή- θα προκαλέσει εντέλει την εμφάνιση πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων μέσα στο μόσχευμα. Ένα ακόμα ζήτημα είναι κατά πόσον η παθολογική p.A53T αSyn μπορεί να εξαπλωθεί από το μόσχευμα στον εγκέφαλο του ξενιστή, όπως έχει δειχθεί σε in vitro καλλιέργειες. Συγκεφαλαιώνοντας, η παρούσα μελέτη αποτελεί την πρώτη προσπάθεια να μελετηθεί η νόσος Πάρκινσον σε χιμαιρικό μοντέλο εγκεφάλου με μεταμόσχευση ανθρώπινων κυττάρων ασθενούς στον ποντικό. Περαιτέρω ανάλυση των φαινοτύπων που αποκτούν τα κύτταρα ασθενών σε μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα, ενδεχομένως με τη χρήση εναλλακτικού ζωικού μοντέλου, καθώς και η ανάλυση πολλαπλών iPSC κλώνων από διαφορετικούς ασθενείς θα επεκτείνει την τρέχουσα μελέτη με σκοπό την ανάπτυξη in vivo χιμαιρικών μοντέλων για τη μελέτη της νόσου Πάρκινσον.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder characterized by motor and non-motor symptoms arising from loss of striatal-projecting dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta as well as of other types of neurons throughout the brain. Even though it is still unknown whether dopamine neuron degeneration is an initial disease feature or the inevitable consequence of multiple dysfunctions throughout the brain, it represents a common pathological manifestation in PD and is responsible for many of the clinical symptoms. A major neuropathological hallmark of PD is the presence of intracellular protein aggregates in the cell bodies and neurites of affected neurons, respectively termed Lewy bodies and Lewy neurites, which are mainly composed of α-synuclein (αSyn). This is a small pre-synaptic protein whose physiological function is still under investigation, yet its pathological involvement in PD is widely accepted. αSyn is the major sporadic PD ...
Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder characterized by motor and non-motor symptoms arising from loss of striatal-projecting dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta as well as of other types of neurons throughout the brain. Even though it is still unknown whether dopamine neuron degeneration is an initial disease feature or the inevitable consequence of multiple dysfunctions throughout the brain, it represents a common pathological manifestation in PD and is responsible for many of the clinical symptoms. A major neuropathological hallmark of PD is the presence of intracellular protein aggregates in the cell bodies and neurites of affected neurons, respectively termed Lewy bodies and Lewy neurites, which are mainly composed of α-synuclein (αSyn). This is a small pre-synaptic protein whose physiological function is still under investigation, yet its pathological involvement in PD is widely accepted. αSyn is the major sporadic PD linked gene, whereas point mutations and multiplications of the locus cause an autosomal dominant form of the disease, often characterized by early onset and a generally severe phenotype. The best-studied αSyn mutation is p.A53T (G209A in the SNCA gene), first identified in families of Italian and Greek ancestry. Although the majority of PD cases are sporadic, studies on familial forms that are clinically and neuropathologically similar to sporadic PD have assisted in gaining insights into PD etiopathology.Although 200 years have elapsed since the disease was first described and despite intensive research efforts towards understanding the disease using animal models and post-mortem human brain tissues, the causes that lead to the appearance and progression of PD remain largely unresolved. Moreover, there is an unmet need for the development of effective therapies since currently available treatments address the symptoms, but do not cure the disease. A major drawback has been the lack of appropriate models simulating efficiently the human disease. As a consequence several therapeutic approaches that appeared promising at a preclinical level, failed to deliver the expected results when tested in clinical trials. Nowadays the advent of cell reprogramming technologies and the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) have opened up new prospects for understanding PD pathogenesis and progression in a patient-specific setting. These approaches allow the generation of patient-derived disease models by directed differentiation of iPSCs to the desired cell types of the brain and also offer the possibility for drug discovery or repositioning in a human setting.In recent years several studies have used iPSC-based cellular systems generated from patient cells as a valuable means for modeling PD in vitro. These investigations revealed a number of disease-associated phenotypes, including increased sensitivity to oxidative and nitrosative stress, mitochondrial deficits, and axonal defects and synaptopathy. In a 2017 collaborative study led by Kouroupi et al. at the Laboratory of Cellular and Molecular Neurobiology – Stem Cells of the Hellenic Pasteur Institute, a disease-in-a-dish model for familial PD was developed using induced pluripotent stem cells (iPSCs) from two patients carrying the p.A53T α-synuclein (αSyn) mutation. By directed differentiation, a PD model was generated that displays protein aggregation, compromised neurite outgrowth, axonal neuropathology and synaptic defects. In this work we aimed to answer whether the vulnerability of these p.A53T (designated PD) iPSC-derived neurons is also retained in an in vivo setting after transplantation in the rodent brain. Towards this, we investigated the in vivo phenotypes of iPSC-derived cells from one p.A53T patient in comparison to control iPSCs derived from a healthy donor, after transplantation in a lesion mouse model established by unilateral intrastriatal 6-hydroxydopamine (6-OHDA) injection in the immunosuppressed NOD/SCID strain. To direct the differentiation of control and PD iPSC lines towards the dopaminergic lineage, we applied a floor plate induction protocol that involves the use of a cocktail of small molecules that either inhibit the BMP/ TGF-β/ Activin pathways or activate the sonic hedgehog pathway and WNT signaling followed by neuronal differentiation-promoting factors. At the end of floor plate induction (11 days in vitro; DIV), practically all cells were LMX1A-positive floor plate neuroepithelial cells and about 50% were LMX1A/FOXA2-positive dopaminergic precursors. Engraftable neurons were obtained with this protocol after 25 DIV, and in order to avoid cellular overgrowth, further enrichment in PSA-NCAM-positive neuronal cells was achieved at 28 DIV by isolation on magnetic beads covered with an antibody against PSA-NCAM. Sorted cells comprised primarily of immature neurons (approximately 70%) as assessed by expression of the neuronal lineage markers doublecortin (DCX) and βΙΙΙ-Tubulin while a proportion were nestin-positive neuronal precursors, with no statistically significant differences between control and PD cells.Because the differentiation protocol used in this work was different from that previously reported in the Kouroupi study, before proceeding to in vivo transplantation we addressed the phenotype of PD cultures maintained for longer periods of time in vitro, in terms of cell morphology and functionality that included electrophysiological recordings and calcium imaging. In PD cells analyzed between 45-70 DIV, degeneration signs became apparent. DCX-positive immature PD neurons exhibited aberrant neuritic growth whilst intracellular protein aggregates were detected in both DCX- and tyrosine hydroxylase-positive (TH) dopaminergic PD neurons. Additionally TH-positive PD cells, which formed a dense network at 70 DIV, displayed dystrophic neurites with swollen varicosities that quite often ended up in fragmented processes. Up-regulation of αSyn protein, indicative of pathology, was also noted in PD neurons as compared to controls. In terms of functionality, electrophysiological recordings did not reveal statistically significant differences on active and passive membrane properties between control and PD cells. Interestingly, however, calcium imaging demonstrated a higher frequency of spontaneous calcium transients in PD cells with a significantly larger mean amplitude. As calcium dynamics regulate neurite growth and synaptic connectivity, the observed alterations in calcium signaling should impact on, and explain, the morphological phenotypes of PD neurons.To investigate the in vivo phenotype of PSA-NCAM-enriched iPSC-derived cells at 30 DIV, we established a 6-hydroxydopamine (6-OHDA) lesioned mouse model in the NOD/SCID strain that supports xenograft survival. A unilateral lesion was induced by intrastriatal injection of 6-OHDA in 9-10 week old mice and the resulting functional deficit was confirmed 2 weeks later using drug-induced and drug-free behavioral analysis. However, functional analysis in longer time periods up to 15 weeks revealed a spontaneous behavioral recovery in the lesioned animals. Although a 60% loss of TH-positive neurons was verified by immunohistochemistry in the substantia nigra which remained stable over 15 weeks, striatal dopaminergic reinnervation was observed in agreement with the concurrent behavioral recovery. This phenomenon could be explained by sprouting of remaining undamaged dopaminergic fibers within the ipsilateral lesioned striatum and/or by a cross-hemispheric compensatory mechanism by which TH fibers originating in the contralateral substantia nigra are induced to project into the ipsilateral striatum.Next, we proceeded to cell transplantation and immunohistochemical analysis of the graft and the surrounding host environment. To investigate their phenotypic characteristics in vivo, control and PD iPSC-derived PSA-NCAM-enriched cells (30 DIV) were transplanted 3 weeks after 6-OHDA injection and immunohistochemical analysis followed after another 12 weeks. The analysis revealed that despite the disease-related characteristics that PD cells displayed when maintained up to 70 DIV, they could survive and differentiate in vivo over a 12-week period. However, interesting differences were noted between patient-derived and control grafts. First, a significant rise in αSyn immunoreactivity was noted in PD grafted cells indicative of a first step towards pathology. Second, control-derived grafts appeared to integrate better than PD grafts within the host tissue extending projections that formed more contacts with host striatal neurons. Third, significantly more DCX-positive immature neurons were found in PD derived grafts as compared to controls, suggesting that PD neurons are stalled at this immature differentiation state. This observation is likely to account for their compromised ability to extend neurites and form contacts with host neurons. Overall our data suggest that the distinct disease-related characteristics which p.A53T cells develop in vitro, may be attenuated or take longer to emerge in vivo after transplantation within the mouse brain. Considering the limited numbers of TH-positive neurons present in both control and PD grafts it is desirable to examine in future studies longer time points, exceeding 6 months after transplantation, which is a challenging task given the increased mortality rate of the 6-OHDA lesioned NOD/SCID mice. Long-term studies are also needed to clarify whether the elevation in αSyn immunoreactivity seen in PD grafts - a phenotype that cannot be attributed to their more immature state - would eventually result in a pathological phenotype with formation of protein aggregates in mature neurons. Another issue is whether p.A53T pathology can spread from the graft to the host environment. Cell to cell seeding of αSyn and transmission of pathology from patient to healthy human neurons has been recently observed in vitro. Whether this may also occur in vivo remains to be seen.To conclude, further analysis of the phenotypes that patient cells acquire over longer periods of time as well as the use of multiple iPSC clones from different patients should extend our current proof-of-concept study and provide additional evidence for in vivo disease modeling.
περισσότερα
