Μελέτη των γενετικών παραγόντων της ιδιοπαθούς φλεγμονώδους εντερικής νόσου (ΙΦΕΝ)

Abstract

Introduction: There is evidence that genotyping for Thiopurine methyl-transferase (TPMT) gene variants is useful for the prediction of response to thiopurine analogues (azathioprine and 6-mercaptopurine) in patients with inflammatory bowel disease (IBD). Polymorphisms of the ABCB1 gene (coding for p-glycoprotein 170) have been associated with inflammatory bowel disease (IBD) and resistance to treatment but the reported results are conflicting. The aim of the present study was to determine the prevalence of TPMT gene polymorphisms in a genetic homogenous population of IBD patients in Crete and to correlate results with adverse reactions to thiopurine drugs and to determine the frequency and role of ABCB1 gene polymorphisms in Cretan IBD patients and study any possible association with susceptibility to Inflammatory bowel disease (ulcerative colitis and Crohn’s disease), as well as resistance to medical treatment (need for surgical intervention). Methods: A total of 223 consecutive IBD patients [111 Crohn’s disease (CD) and 112 ulcerative colitis (UC)] were reviewed for disease phenotype, response to treatment and need for colectomy. Genotyping for the commonest TPMT variants, TPMT*3A, TPMT3*C, TPMT*3B using PCR-RFLP method as well as allele-specific PCR for TPMT*2 was performed in 223 consecutive IBD patients and 119 age and sex matched healthy controls. The hospital medical records were reviewed for thiopurine use in these patients and related adverse events. All patients and the control group were genotyped for ABCB1 gene polymorphisms (G2677T/A and C3435T) by using the PCR-RFLPs method. Results: The prevalence of TPMT variants TPMT*2, TPMT*3A, TPMT*3B and TPMT*3C was 1.8%, 2.7%, 1.3% and 1.8% respectively. G238C mutation was detected in 4 out of 223 (1.8%) patients, 3 (1.3%) patients were carriers of G460A mutation, 4 (1.8%) of A719G mutation and 6 (2.7%) of both G460A and A719G mutation. In healthy controls only one (0.8%) carried both the G460A and A719G mutation whereas TPMT*2, TPMT*3C and TPMT*3B were not detected. Νone of the genotypes was homozygous. A statistically significant correlation between the presence of G460A mutation and the development of leucopenia after thiopurines administration was observed (p=0.048). Allele and genotype frequencies of G2677T/A and C3435T polymorphisms were found to be similar in IBD patients and healthy controls. There was no statistically significant correlation between any of the mutant variants studied and IBD or CD. A statistically significant correlation between the presence of 2677T mutation and UC was observed (p=0.049). No association of G2677T/A or C3435T with clinical phenotype, or resistance to treatment was also found. However, 59% of 34/223 patients who did not respond to therapy and required surgery, where found to carry both the C3434T and the G2677T alleles.Conclusion: This study showed lower frequency of total TPMT variants and higher frequency of TPMT*3B in Cretan IBD patients compared to other Caucasian populations. The presence of G460A mutation is associated with the development of leucopenia. Furthermore, our study showed correlation of the G2677T polymorphism and UC, while failed to demonstrate any correlation between the C3435T and G2677A polymorphisms of ABCB1/MDR1 and the development of IBD, CD, disease phenotype or response to treatment. There was a trend towards association of the combined carriage of G2677T and C3435T mutations with disease refractory to treatment.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Υπάρχουν ενδείξεις ότι ο γενετική ανάλυση του γονιδίου θειοπουρινική μεθυλ-τρανσφεράση (ΤPMT) είναι πολύ χρήσιμη για την πρόβλεψη της ανταπόκρισης των ασθενών μετά την χορήγηση θειοπουρινικών φαρμάκων (αζαθειοπρίνη και 6-μερκαπτοπουρίνη) σε ασθενείς με Ιδιοπαθή φλεγμονώδη νόσο του εντέρου (ΙΦΝΕ). Επιπλέον, οι απλοί νουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί του γονιδίου ABCB1, το οποίο κωδικοποιεί την p-γλυκοπρωτείνη, έχουν συσχετιστεί με την εκδήλωση ΙΦΝΕ (ελκώδη κολίτιδα και νόσο Crohn) καθώς και με νόσο ανθεκτική στην θεραπεία, αλλά τα αποτελέσματα είναι αντικρουόμενα. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν ο καθορισμός της επίπτωσης των απλών νουκλεοτιδικών πολυμορφισμών του γονιδίου TPMT στον γενετικά ομοιογενή πληθυσμό των ασθενών με ΙΦΝΕ στην Κρήτη και η συσχέτιση των αποτελεσμάτων με την εκδήλωση ανεπιθύμητων ενεργειών μετά την λήψη θειπουρινικών φαρμάκων. Επιπρόσθετα στην παρούσα μελέτη καθορίστηκε η συχνότητα των πολυμορφισμών στου γονιδίου ΑΒCB1/MDR1 στους ίδιους ασθενείς και μελετήθηκε πιθανή συσχέτισή τους με την εκδήλωση ΙΦΝΕ (ελκώδη κολίτιδα και νόσο Crohn) αλλά και με την ανθεκτική στην θεραπεία νόσο (ανάγκη χειρουργικής αντιμετώπισης). Mέθοδος: Συνολικά 223 ασθενείς με ΙΦΝΕ [111 ασθενείς με νόσο Crohn (ΝC) και 112 ασθενείς με ελκώδη κολίτιδα (ΕΚ)] ανασκοπήθηκαν όσον αφορά στον φαινότυπο της νόσου, την ανταπόκριση στην φαρμακευτική αγωγή και στην ανάγκη χειρουργικής αντιμετώπισης. Πραγματοποιήθηκε γενετική ανάλυση για τους συχνότερους απλούς νουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς του γονιδίου TPMT, G460A, A719G με εφαρμογή PCR και ανάλυση μεγέθους περιοριστικών τμημάτων (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism) καθώς και PCR ειδική για το αλληλόμορφο για τον πολυμορφισμό G238C στους 223 ασθενείς με ΙΦΝΕ και σε 119 υγιή άτομα της ομάδας ελέγχου, αντίστοιχης ηλικίας και φύλου. Τα νοσοκομειακά αρχεία ανασκοπήθηκαν για την χρήση θειοπουρινικών φαρμάκων από τους ασθενείς αυτούς καθώς και για την εκδήλωση παρενεργειών αλλά και την ανάγκη χειρουργικής αντιμετώπισης. Πραγματοποιήθηκε γενετική ανάλυση τόσο των ασθενών όσο και της ομάδας ελέγχου για την ανίχνευση των πολυμορφισμών G2677T/A και C3435T του γονιδίου ΑΒCB1/MDR1 με PCR και ανάλυση μεγέθους περιοριστικών τμημάτων (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism).Αποτελέσματα: η επίπτωση των γονοτύπων του γονιδίου TPMT, TPMT*2, TPMT*3A, TPMT*3B και TPMT*3C ήταν 1.8%, 2.7%, 1.3% και 1.8% αντίστοιχα. Η μεταλλαγή G238C mutation ανιχνεύτηκε σε 4 από τους 223 (1.8%) ασθενείς, 3 (1.3%) ασθενείς έφεραν την μεταλλαγή G460A, 4 (1.8%) την μεταλλαγή A719G και 6 (2.7%) και την G460A και την A719G μεταλλαγή. Στην ομάδα ελέγχου, μόνον 1 ασθενής (0.8%) ήταν φορέας και των δύο μεταλλαγών, G460A και A719G mutation ενώ οι γονότυποι TPMT*2, TPMT*3C και TPMT*3B δεν ανιχνεύτηκαν. Δεν βρέθηκαν άτομα ομόζυγα για τις μεταλλαγές. Παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας του πολυμορφισμού G460A και της εκδήλωσης ουδετεροπενίας μετα την χορήγηση θειοπουρινικών φαρμάκων (p=0.048). Οι συχνότητες των γονοτύπων και των αλληλομόρφων των πολυμορφισμών C3435Τ και G2677A σε ασθενείς και υγιείς μάρτυρες ήταν παρόμοιες. Δεν υπήρξε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ των ανωτέρων πολυμορφισμών και της εκδήλωσης ΙΦΝΕ ή νόσου Crohn. Διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ του αλληλομόρφου 2677Τ και της εκδήλωσης ελκώδους κολίτιδας. (p=0.049). Δεν βρέθηκε συσχέτιση μεταξυ της παρουσίας των πολυμορφισμών και του φαινότυπου της νόσου ή της ανθεκτικής στην θεραπεία νόσου. Ωστόσο, το 59% των 34 που δεν ανταποκρίθηκαν στην φαρμακευτική αγωγή και υπεβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση ήταν φορείς των μεταλλαγμένων αλληλομόρφων 3435Τ και 2677Τ.Συμπέρασμα: Στην παρούσα μελέτη διαπιστώθηκε μικρότερη επίπτωση των αλληλομόρφων του γονιδίου TPMT και υψηλότερη συχνότητα του γονοτύπου TPMT3B στους Κρήτες ασθενείς με ΙΦΝΕ σε σχέση με άλλους Καυκάσιους πληθυσμούς. Η παρουσία της μεταλλαγής G460A συσχετίστηκε με την εκδήλωση ουδετεροπενίας. Επιπλέον, διαπιστώθηκε συσχέτιση του αλληλομόρφου 2677Τ με την εκδήλωση ελκώδους κολίτιδας, ενώ δεν διαπιστώθηκε συσχέτιση των πολυμορφισμών C3435T και G2677T/A με την εκδήλωση ΙΦΝΕ, νόσου Crohn, με τον φαινότυπο της νόσου ή την ανθεκτική στην θεραπεία νόσο.