Ανάπτυξη μεθόδων προσδιορισμού κυανοτοξινών και οργανικών ρύπων σε νερά με υγροχρωματογραφία - συζευγμένη φασματομετρία μαζών

Abstract

Cyanobacteria, also known as blue-green algae, are present in surface waters and under favorable environmental conditions can form extensive algal blooms and release hazardous toxic compounds (cyanotoxins), posing a significant risk to aquatic ecosystems, drinking water sources and human health. Cyanotoxins comprise a large group of organic compounds, with a variety of physicochemical properties, chemical structures and toxic activity (hepatotoxicity, neurotoxicity, cytotoxicity, dermatotoxicity). Cyanotoxins are classified based on their structure on cyclic peptides (i.e. Microcystins, Nodularins), alkaloids (i.e. Cylindrospermopsin, Anatoxin), lipopolysaccharides and amino acids. Most of the studies on the occurrence of cyanotoxins have been targeted to specific compounds or to variants within a class of cyanotoxins. In this thesis, a fast, simple and sensitive analytical method was developed for the simultaneous determination of multi-class cyanobacterial and algal toxins in water in one run. The target compounds were: Cylindrospermopsin, Anatoxin-a, Nodularin, 12 Microcystins ([D-Asp3]MC-RR, MC-RR, MC-YR, MC-HtyR,[D-Asp3]MC-LR, MC-LR, MC-HilR, MC-WR, MC-LA, MC-LY, MC-LW and MC-LF), Okadaic acid and Domoic acid. Analytes were determined using liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) in MRM mode. A dual Solid Phase Extraction (SPE) cartridge assembly (two tandem SPE cartridges, Oasis HLB and Hyper PGC) was applied for the efficient extraction of target compounds from water. Moreover, a method was developed for the simultaneous extraction of several cyanotoxins (Cylindrospermopsin, Anatoxin-a and Microcystins) from lyophilized cyanobacterial biomass. During method development several extraction parameters were evaluated. Detection and identification of cyanotoxins Cylindrospermopsin, Anatoxin-a and a wide range of Microcystins in Greek lakes for the first time have demonstrated the applicability and efficiency of the proposed methods.Apart from the natural contaminants of water there are also anthropogenic contaminants with emerging concern. The latest EU Directive on Environmental Quality Standards (EQS Directive 2013/39/EU) has proposed new strategies against water pollution and novel monitoring methods for priority substances. Additionally, the EU Decision 2015/495/EE has established a watch list of emerging contaminants for Union-wide monitoring in the field of water policy. The above directives and decisions implements revised and stricter EQS and making necessary the development and validation of novel multi-residue methods for the determination of micropollutants of water. In this thesis, the development of a novel method for the simultaneous determination of various organic pollutants (i.e. pesticides, endocrine disruptors, pharmaceuticals) in water is presented. The 29 target compounds (17α-Ethinylestradiol, β-Estradiol, Diclofenac, Alachlor, Atrazine, Chlorfenvinphos, Chlorpyriphos, Diuron, Isoproturon, Simazine, Trifluralin, Pentachlorophenol, 2.4.6-Trichlorophenol, Azinphos-ethyl, Azinphos-methyl, Chlorotoluron, Cyanazine, Diazinon, Dimethoate, Ethion, Fenthion, Linuron, Malathion, Methidathion, Metribuzine, Monuron, Phosalone, Propazine and Triazophos), 13 of which are either considered as priority substances or included in watch list and the rest 16 were widely used pesticides many of them have been banned, were determined using liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) in MRM mode. SPE method, utilizing Oasis HLB cartridges, was developed for sample clean-up and analytes preconcentration from water, enabling high sensitivity with LODs at ng/L level.

Τα κυανοβακτήρια αναπτύσσονται στο υδάτινο περιβάλλον και κάτω από ευνοϊκές συνθήκες πολλαπλασιάζονται σχηματίζοντας έντονες ανθίσεις (blooms) ελευθερώνοντας συχνά στο νερό τοξικούς δευτερογενείς μεταβολίτες, τις κυανοτοξίνες που αποτελούν σημαντικό κίνδυνο για τα υδάτινα οικοσυστήματα, τους ταμιευτήρες πόσιμου νερού και την δημόσια υγεία. Οι κυανοτοξίνες είναι μία μεγάλη ομάδα ενώσεων με ποικίλες φυσικοχημικές ιδιότητες, χημικές δομές και τοξική δράση (ηπατοτοξικές, νευροτοξικές, δερματοτοξικές, κυτταροτοξικές). Οι κυανοτοξίνες κατηγοριοποιούνται κυρίως με βάση τη δομή τους σε κυκλικά πεπτίδια (όπως Microcystins, Nodularins), αλκαλοειδή (όπως Cylindrospermopsin, Anatoxin), λιποπολυσακχαρίτες και αμινοξέα. Οι περισσότερες μελέτες για την ανάλυση των κυανοτοξινών εστιάζουν στον προσδιορισμό μίας κατηγορίας κυανοτοξινών. Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε μία γρήγορη, απλή και ευαίσθητη αναλυτική μέθοδος για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό διαφορετικών κατηγοριών κυανοτοξινών (Cylindrospermopsin, Anatoxin-a, Nodularin, 12 Microcystins ([D-Asp3]MC-RR, MC-RR, MC-YR, MC-HtyR,[D-Asp3]MC-LR, MC-LR, MC-HilR, MC-WR, MC-LA, MC-LY, MC-LW και MC-LF), καθώς και των πολύ διαδεδομένων θαλάσσιων φυκοτοξινών Okadaic acid και Domoic acid στο νερό με μία μόνο ανάλυση. Ο προσδιορισμός των ενώσεων έγινε με υγροχρωματογραφία – συζευγμένη φασματομετρία μαζών (LC-MS/MS). Για την προκατεργασία του δείγματος και την αποτελεσματική εκχύλιση όλων των αναλυτών από το νερό αναπτύχθηκε μέθοδος εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE), με διάταξη διπλού φυσιγγίου αποτελούμενη από Oasis HLB και Hyper PGC. Επιπλέον, αναπτύχθηκε μέθοδος για την ταυτόχρονη εκχύλιση διαφορετικών κατηγοριών κυανοτοξινών (Cylindrospermopsin, Anatoxin-a and Microcystins) από λυοφιλοποιημένη κυανοβακτηριακή βιομάζα, όπου μελετήθηκε η επίδραση διάφορων παραγόντων στην απόδοση της εκχύλισης. Οι αναπτυχθείσες μέθοδοι εφαρμόστηκαν αποτελεσματικά στην ανάλυση δειγμάτων από λίμνες της Ελλάδας, όπου ανιχνεύθηκε και ταυτοποιήθηκε για πρώτη φορά στον ελλαδικό χώρο η παρουσία των κυανοτοξινών Cylindrospermopsin, Anatoxin-a και ποικίλων Microcystins. Οι οργανικοί ρύποι του νερού, εκτός από φυσικής προέλευσης, είναι και επικίνδυνες ουσίες από ανθρωπογενείς δραστηριότητες. Στα πλαίσια της προστασίας του υδάτινου περιβάλλοντος και της δημόσιας υγείας εκδόθηκε η πιο πρόσφατη ευρωπαϊκή οδηγία (2013/39/ΕΕ) για τις ουσίες προτεραιότητας με αναθεωρημένα και αυστηρότερα πρότυπα ποιότητας περιβάλλοντος (ΠΠΠ) και με την απόφαση 2015/495/ΕΕ δημιουργήθηκε ο πρώτος κατάλογος επιτήρησης με αναδυόμενους ρύπους του νερού. Οι οδηγίες αυτές προτείνουν νέες στρατηγικές για την αντιμετώπιση της ρύπανσης του νερού και την ανάπτυξη νέων μεθόδων για την συστηματική παρακολούθηση των ρύπων του νερού. Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε μία πολυδύναμη μέθοδος για τον προσδιορισμό 29 οργανικών ρύπων του νερού (17α-Ethinylestradiol, β-Estradiol, Diclofenac, Alachlor, Atrazine, Chlorfenvinphos, Chlorpyriphos, Diuron, Isoproturon, Simazine, Trifluralin, Pentachlorophenol, 2,4,6-Trichlorophenol, Azinphos-ethyl, Azinphos-methyl, Chlorotoluron, Cyanazine, Diazinon, Dimethoate, Ethion, Fenthion, Linuron, Malathion, Methidathion, Metribuzine, Monuron, Phosalone, Propazine και Triazophos) με LC-MS/MS, εκ των οποίων οι 13 περιλαμβάνονται είτε στις ουσίες προτεραιότητας είτε στον κατάλογο επιτήρησης και οι υπόλοιπες 16 είναι ευρέως χρησιμοποιηθέντα φυτοφάρμακα, πολλά εκ των οποίων έχουν απαγορευθεί. Για τον καθαρισμό του δείγματος και την προσυγκέντρωση των αναλυτών από το νερό, αναπτύχτηκε μέθοδος SPE επιτυγχάνοντας υψηλή ευαισθησία με LODs της τάξης των ng/L.