Generation and characterization of novel mouse models to validate the role of KLK5 protease in inflammation for pharmacological applications

Abstract

Kallikrein-related peptidase 5 (KLK5 for human; Klk5, for mouse) or kallikrein 5 or stratum corneum tryptic enzyme (SCTE) is a serine protease and a pivotal regulator of skin desquamation, the physiological process of skin renewal (Brattsand et al., 2005; Borgoño et al., 2007). KLK5 is activated autocatalytically (Michael et al., 2005) and then, it activates other downstream proteases that are expressed in the epidermis, such as the KLK7 and KLK14 zymogens, to amplify the proteolytic activities that are engaged in cleavage of the outermost skin desmosomes. It is known that KLK5 hyperactivity is involved in pathological epidermal overdesquamation and inflammation associated with rare diseases, such as the Netherton syndrome (NS). In NS epidermis, genetic deficiency of the LEKTI inhibitor of serine proteases results in unopposed activity of KLK5 (and other serine proteases), which promotes skin inflammation via activation of the PAR2-NF-κB-TNFα signaling axis (Briot et al., 2009). In addition, proteolytic cleavage of cathelicidin by KLK5 results in production of antimicrobial and proinflammatory peptides (Yamasaki et al., 2006). Interestingly, the KLK5-PAR2-NF-κB-TNFα signaling pathway is activated and triggers inflammation also in common inflammatory skin disorders such as atopic dermatitis (AD) (Zhu et al., 2017; Elias PM, 2010).PART I: Novel mouse models provide preclinical proof-of-concept for the combined use of KLK5 inhibitors and anti-TNFα therapeutics for effective treatment of Netherton syndrome. NS is an autosomal recessive multisystemic skin disorder that is characterized by severe epidermal overdesquamation and inflammation, infections, food and other allergies as a consequence of the extensive disruption of the skin barrier occasionally leading to neonatal lethality due to dehydration but also other systemic complications. NS is caused by mutations in SPINK5 (Serine Protease Inhibitor Kazal-Type) gene encoding the inhibitor LEKTI (Lympho Epithelial Kazal-Type-related Inhibitor) of serine proteases. LEKTI deficiency results in unopposed activities of serine proteases in the epidermis of NS patients. Spink5-/- mice recapitulate all major features of human NS, thus, providing a good model to study the disease. Spink5-/- mice are born apparently normal, nonetheless, within 30 min from birth they develop severe epidermal overdesquamation and inflammation and die uniformly 4-5 hours after birth due to extensive dehydration (Descargues et al., 2005). In a recent study published by our group in collaboration with Prof. Alain Hovnanian’s group, transgenic Spink5-/-Klk5-/- mice were generated to assess whether inhibition of KLK5 activity could be a pharmacological approach for NS. It should be noted that no specific therapy is currently available for NS. It was demonstrated that elimination of Klk5 in Lekti-deficient epidermis reverses the cutaneous hallmarks of NS in the early neonatal period (Furio et al., 2015). Spink5-/- mice have been generated by different groups, by differing transgenic approaches, and all show the same lethal phenotype (Yang et al., 2004; Descargues et al., 2005; Hewett et al., 2005; Kasparek et al., 2016). Here, Spink5-/-Klk5-/- mice were generated newly and monitored to evaluate whether inhibition of Klk5 could rescue NS for long periods. The Spink5-/- mice used in this study were provided by Prof. Andrew McKenzie and mimic the clinical features of NS (Hewett et al., 2005). We found that 70% of Spink5-/-Klk5-/- mice develop severe skin inflammation 5 to 7 days after birth triggered by activation of the Par2-NF-κB-Tnfα axis resulting in overexpression of the pro-Th2 cytokine Tslp and the proinflammatory cytokine Tnfα. Increased transcript levels of Il-1β, the Th17 type cytokine Il-17α and Il-23 were also observed in Spink5-/-Klk5-/- epidermis and strong infiltration by mast cells. In addition, aberrantly high proteolytic activities were detected in Spink5-/-Klk5-/- epidermis. Using several protease inhibitors with different substrate specificities a band corresponding to chymotrypsin-like activity was identified. By day 5-7, Spink5-/-Klk5-/- mice had developed a skin barrier defect as indicated by the toluidine blue dye penetration assay. The skin barrier defect is caused by the abnormally elevated proteolysis leading to enhanced cleavage of desmosomes and stratum corneum detachment, and secretion of the proinflammatory cytokine Il-1β by keratinocytes (Wood et al., 1992). Immunohistochemical staining showed reduced levels of the (corneo)desmosomal proteins Dsg1, Cdsn and Dsc1 and diffused staining likely a consequence of enhanced proteolytic cleavage. Further, decreased expression of involucrin and loricrin in Spink5-/-Klk5-/- epidermis indicated abnormal skin differentiation. Overall, we found that ~70% of Spink5-/-Klk5-/- mice die 5 to 7 days after birth due to severe skin overdesquamation and inflammation, which indicated that elimination of Klk5 alone is not sufficient to sustain a normalized skin barrier for long periods of time. A recent study showed that combined targeting of KLK5 and KLK7 proteases is indispensable for permanent restoration of the skin barrier defect in NS (Kasparek et al., 2016). Nonetheless, a major disadvantage of using cocktails of micromolecular inhibitors against KLK5 and KLK7 in humans is the current unavailability of specific inhibitors for KLK7, while KLK5 inhibitors are currently in development by Pharma (Personal communication; undisclosed). Thus, we investigated whether combined targeting of KLK5 and inflammatory pathways known to be involved in NS-associated inflammation could be an effective therapeutic approach. To provide proof-of-concept for such a pharmacological approach in humans, we have generated and characterized in depth the following novel preclinical mouse models: [1] Spink5-/-Klk5-/-Camp-/- and [2] Spink5-/-Klk5-/-Tnfα-/- mice in which, in addition to Klk5, the Camp gene (innate immunity), which encodes the cathelicidin precursor, and the Tnfa gene (adaptive immunity) were targeted, respectively. The percentage of mice that suffered postnatal lethality was not improved in Spink5-/-Klk5-/-Camp-/- mice, however, an increased lifespan was observed and some Spink5-/-Klk5-/-Camp-/- mice survived for 1 year, while none of the Spink5-/-Klk5-/- population survived longer than 8 months. Adult Spink5-/-Klk5-/-Camp-/- and Spink5-/-Klk5-/- mice exhibited epidermal overdesquamation and inflammation, and they died of an apparent skin barrier defect. Haemorrhagic areas were observed in the stomach of both genotypes in adult life but to a lesser extent in Spink5-/-Klk5-/-Camp-/-, however, the underlying molecular mechanisms were not investigated in terms of the present study. In Spink5-/-Klk5-/-Tnfa-/- mice, the skin barrier defect was fully reversed, no cutaneous abnormalities were observed macroscopically or microscopically, and no detached keratinocytes were identified in the surface of epidermis by scanning electron microscopy (SEM) and by hematoxylin/eosin staining of skin biopsies. Skin structure appeared normal with no detachment of the stratum corneum from the stratum granulosum, no hyperkeratosis or acanthosis. Furthermore, the expression levels of Dsg1, Cdsn and Dsc1 and of involucrin, loricrin and keratin 5 were normalized. Epidermal proteolytic activities were attenuated in Spink5-/-Klk5-/-Tnfa-/- and no skin inflammation was induced as reflected by the low numbers of infiltrating mast cells and lack of Par2 activation. Consistently, the cytokines Tslp, Il-1β, Il-17α, and Il-23 were not induced. Overall, 80% of Spink5-/-Klk5-/-Tnfa-/- mice have survived to adulthood. Adult Spink5-/-Klk5-/-Tnfα-/- mice sustain a normal skin microstructure with no inflammation or aberrant proteolysis and looked apparently like the wt mice except that they experience successive cycles of hair loss and regrowth. Permanent amelioration of the uniformly neonatal lethal phenotype of Spink5-/- mice by combined targeting of Klk5 and Tnfα is quite remarkable. It should be noted that anti-TNFα biologic factors are widely used in clinics as effective drugs for varying indications. Based on the described findings, we propose that the use of synthetic KLK5 inhibitors in combination with anti-TNFα biologic factors may represent a novel effective pharmacological approach for NS.PART II: Investigating the role of KLK5 protease in skin cancer. Early skin tumorigenesis is suppressed in Klk5-deficient epidermis by reinforcement of the skin microstructure. KLK5 has been implicated in various types of cancer based on its aberrant expression in human tumors such as breast, testicular, renal and ovarian (Emani et al., 2008). However, not much is known on the underlying mechanisms. Considering that KLK5 is implicated in NS inflammation as elaborated above, we investigated whether KLK5 plays a role in skin cancer in vivo, since chronic inflammation is an important risk factor for the development of non-melanoma skin cancer. Skin carcinogenesis was induced in wt and Klk5-/- mice by application of DMBA/TPA or DMBA/DMBA according to established protocols. We show that Klk5-/- mice are resistant to early skin tumorigenesis. By contrast, the significantly fewer tumors that developed in Klk5-/- skin progressed faster to premalignant and malignant phenotypes. We have hypothesized that suppressed tumor formation in Klk5-deficient skin could reflect low inflammation because Par2-Nf-κb signaling is not activated. However, inflammation was much higher in Klk5-/- than in wt upon epicutaneous application of TPA. We have generated Tg-NglKlk5-/- mice to monitor Nf-κb activation in vivo. Specifically, Klk5-/- mice were intercrossed with Ngl transgenic mice carrying the firefly luciferase gene reporter, under the control of a minimal promoter carrying eight Nf-κb consensus sequences (Everhart et al., 2006). Against what we expected, strong activation of Nf-κb was observed in TPA-treated Klk5-/- skin which could not explain why early skin tumor formation is substantially suppressed in Klk5-/-. Thus, we investigated what could be the underlying molecular mechanism(s) that explain how and why Klk5-/- mice are resistant to early skin tumor formation. Since NF-κB activation in cancer cells is inhibited by β-catenin (Du et al., 2009; Deng et al., 2002), we studied the localization of β-catenin and found that, in Klk5-/- mice, β-catenin is not translocated into the nucleus upon TPA application but remains cytoplasmic, while in wt mice studied in parallel β-catenin was nuclear. Inhibition of β-catenin activation could explain the observed tumor suppression in Klk5-/- mice since it is known that β-catenin signaling promotes skin cancer development (Beronja et al., 2013). It should be noted that analysis by TEM of the epidermal ultrastructure revealed that desmosomes are significantly increased in numbers, length and electron density in Klk5-/- compared to wt mice. Thus, we hypothesized that immobilization of β-catenin in the cytoplasm could be associated with reinforced desmosomes in Klk5-/- skin and an enhanced mechanical strength. In fact, this was confirmed by AFM. Further, it is shown that inhibition of β-catenin results in induction of apoptosis as determined by TUNEL indicating that the number of tumors in Klk5-/- skin is likely reduced by apoptotic depletion of mutated keratinocytes. In summary, using Klk5-/- mice for the first time we provide evidence that KLK5 is implicated in early skin tumorigenesis in vivo by inhibiting oncogenic β-catenin signaling. Cumulatively, the present doctoral thesis aims to enhance our understanding of the molecular mechanisms implicated in skin inflammation and the role of Κlk5 protease, and to aid the future development of new effective therapies. The study provides proof-of-concept for the design of innovative therapeutic approaches for overdesquamating inflammatory skin diseases such as NS, but also for more common diseases including atopic dermatitis (AD) that share the underlying molecular mechanisms. Furthermore, the study provides evidence that KLK5 is implicated in early stages of skin tumorigenesis.

Η ανθρώπινη καλλικρεΐνη 5 (KLK5, human kallikrein-related peptidase 5; Klk5, mouse kallikrein-related peptidase 5) είναι μια εξωκυττάρια σερινοπρωτεάση που συμμετέχει κεντρικά στη ρύθμιση της φυσιολογικής διαδικασίας απολέπισης (αποφολίδωσης) του δέρματος (Brattsand et al., 2005; Borgoño et al., 2007). Έχει δειχθεί ότι η πρόδρομος μορφή (ζυμογόνο) της KLK5 ενεργοποιείται αυτοκαταλυτικά (Michael et al., 2005) και θεωρείται ότι, στη συνέχεια, ενεργοποιεί τα ζυμογόνα των πρωτεασών ΚLK7 και KLK14 πυροδοτώντας την ενεργοποίηση ενός πρωτεολυτικού καταρράκτη στην επιδερμίδα, που ελέγχει την αποικοδόμηση πρωτεϊνών όπως η δεσμογλεΐνη 1, η δεσμοκολλίνη 1 και η κορνεοδεσμοσίνη, πρωτεΐνες-συστατικά των δεσμοσωμάτων, και έτσι, η πρωτεάση KLK5 ελέγχει τη διάσπαση των εξώτατων δεσμοσωμάτων της επιδερμίδας. Επίσης, έχει ευρέως δειχθεί ότι η αυξημένη ενεργότητα (έκτοπη ενεργοποίηση) της πρωτεάσης KLK5 εμπλέκεται στην παθολογική φλεγμονή του δέρματος που παρατηρείται σε σπάνια νοσήματα, όπως το σύνδρομο Netherton (ΝS) όπου η υπερενεργοποίηση της KLK5 προάγει τη φλεγμονή του δέρματος μέσω: [1] ενεργοποίησης του υποδοχέα PAR2 με πρωτεολυτική πέψη και επαγωγή του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB που οδηγεί στην παραγωγή TNFα καθοδικά (Briot et al., 2009), και/ή [2] πρωτεόλυσης των πρόδρομων μορίων καθελισιδίνης (Yamasaki et al., 2006) και παραγωγή αντιμικροβιακών και φλεγμονωδών πεπτιδίων. Επίσης, θεωρείται ότι τo σηματοδοτικό μονοπάτι KLK5-PAR2-NF-κB-TNFα εμπλέκεται και σε νοσήματα με μεγάλο επιπολασμό, όπως η ατοπική δερματίτιδα (Zhu et al., 2017; Elias PM, 2010). ΜΕΡΟΣ Ι: Ο χαρακτηρισμός νεοφανών ζωικών προτύπων υποδεικνύει σε προκλινικό επίπεδο ότι η χορήγηση συνθετικών αναστολέων της KLK5 και anti-TNFα βιολογικών παραγόντων αποτελούν αποτελεσματική θεραπεία για το σύνδρομο Netherton. Το σύνδρομο Netherton αποτελεί μια σπάνια γενετική ασθένεια του ανθρώπου η οποία χαρακτηρίζεται από υπεραποφολίδωση και επίμονη φλεγμονή του δέρματος, αλλεργίες, λοιμώξεις ως αποτελέσματα της εκτεταμένης βλάβης του δερματικού φραγμού, η οποία μπορεί να καταλήξει σε νεογνική θνησιμότητα λόγω αφυδάτωσης και άλλων συστημικών επιπλοκών. Το σύνδρομο Netherton είναι υπολειπόμενη νόσος που οφείλεται σε μεταλλάξεις στο ανθρώπινο γονίδιο SPINK5 (Serine Protease Inhibitor Kazal Type) με αποτέλεσμα την ανεπάρκεια στο μεγαλομοριακό αναστολέα σερινοπρωτεασών LEKTI (Lympho Epithelial Kazal Type-related Inhibitor). Ασθενείς που πάσχουν από σύνδρομο Netherton παρουσιάζουν πολύ αυξημένη πρωτεόλυση στην επιδερμίδα. Η ενεργοποίηση της πρωτεόλυσης και η εξ αυτής προκαλούμενη εκτεταμένη βλάβη του δερματικού φραγμού προκαλούν ιδιοσυστατική επαγωγή φλεγμονής στην επιδερμίδα ασθενών με σύνδρομο Netherton. Γενετικά τροποποιημένα ποντίκια που φέρουν αδρανοποιημένο το γονίδιο Spink5 (Spink5-/-) αναπαράγουν σε σημαντικό βαθμό την ανθρώπινη ασθένεια και αποτελούν το καθιερωμένο ζωικό πρότυπο για τη μελέτη του συνδρόμου Netherton. Τα ποντίκια Spink5-/- γεννιούνται φυσιολογικά, αλλά εντός 30 λεπτών της ώρας από τη γέννηση εμφανίζουν εκτεταμένη υπεραποφολίδωση και φλεγμονή στο δέρμα και πεθαίνουν σε περίπου 4-5 ώρες λόγω βαριάς βλάβης του επιδερμικού φραγμού και συνακόλουθη αφυδάτωση (Descargues et al., 2005).Σε πρόσφατη μελέτη της ομάδας μας σε συνεργασία με την ερευνητική ομάδα του Καθηγητή Αlain Hovnanian δημιουργήθηκαν γενετικά (διττά) τροποποιημένοι ποντικοί Spink5-/-Klk5-/- που φέρουν από κοινού αδρανοποιημένα τα γονίδια Spink5 και Klk5, για να αξιολογηθεί εάν η αναστολή της ενζυμικής ενεργότητας της πρωτεάσης ΚLK5 μπορεί να αποτελέσει δυνητική φαρμακολογική προσέγγιση για τη θεραπευτική αντιμετώπιση του συνδρόμου Netherton. Σημειώνεται ότι σήμερα δεν υπάρχει καμιά ειδική θεραπεία για το σύνδρομο Netherton, μια βαριά ασθένεια που αντιμετωπίζεται μόνον παρηγορητικά με αλοιφές. Η ανωτέρω μελέτη έδειξε ότι η εξάλειψη της Κlk5 σε υπόστρωμα συνδρόμου Netherton έχει ως αποτέλεσμα την αποκατάσταση της φυσιολογικής λειτουργίας του δερματικού φραγμού κατά την πρώιμη νεογνική περίοδο (Furio et al., 2015). Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής δημιουργήθηκαν, εκ νέου, ποντικοί Spink5-/-Klk5-/- προκειμένου να αξιολογηθεί μακροπρόθεσμα η αποτελεσματικότητα της αναστολής της πρωτεάσης Κlk5. Τα διαγονιδιακά ποντίκια Spink5-/- που χρησιμοποιήθηκαν εδώ δημιουργήθηκαν από την ερευνητική ομάδα του Καθηγητή Andrew McKenzie και αναπαράγουν πλήρως τα ακραία κλινικά χαρακτηριστικά του συνδρόμου Netherton (Hewett et al., 2005). Παρατηρήθηκε ότι σε διάστημα 5-7 ημερών μετά τη γέννηση οι ποντικοί Spink5-/-Klk5-/- αναπτύσσουν εκ νέου φλεγμονή μέσω ενεργοποίησης του υποδοχέα Par2 και έχουν αυξημένη έκφραση της προ-Th2 κυτταροκίνης Tslp και της φλεγμονώδους κυτταροκίνης Tnfα στην επιδερμίδα. Επιπλέον, βρέθηκε αυξημένη η έκφραση των κυτταροκινών Il-1b, της τύπου Th17 Ιl-17α, και Ιl-23 στο δέρμα των ποντικών Spink5-/-Klk5-/-, το οποίο ήταν επίσης διηθημένο από φλεγμονώδη σιτευτικά κύτταρα, ενώ παρατηρήθηκε εκ νέου υπερενεργοποίηση της πρωτεόλυσης στην επιδερμίδα. Χρησιμοποιώντας γνωστούς αναστολείς πρωτεασών με διαφορετική εξειδίκευση υποστρώματος ταυτοποιήθηκε ότι αυξάνεται η ενζυμική ενεργότητα μιας επιδερμικής σερινοπρωτεάσης τύπου χυμοθρυψίνης. Η λειτουργία του δερματικού φραγμού δεν ήταν φυσιολογική, όπως καταδεικνύεται από την αυξημένη διαπερατότητα της χρωστικής κυανούν της τολουιδίνης και την εκτεταμένη κυανή χρώση ολόκληρου του σώματος των ποντικών. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση της έκφρασης δομικών πρωτεϊνών των δεσμοσωμάτων όπως η δεσμογλεΐνη 1 και η κορνεοδεσμοσίνη, έδειξε μειωμένα επίπεδα λόγω πρωτεολυτικής διάσπασης, που πιθανόν έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση του φυσιολογικού αριθμού δεσμοσωμάτων και της ακεραιότητας του δερματικού φραγμού, με συνακόλουθη παραγωγή της φλεγμονώδους κυτταροκίνης Il-1β από τα κερατινοκύτταρα (Wood et al., 1992). Ανάλυση της έκφρασης των καθιερωμένων δεικτών διαφοροποίησης ινβολουκρίνη και λορικρίνη με ανοσοϊστοχημική χρώση έδειξε μη φυσιολογική διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων. Ως αποτέλεσμα της βλάβης του επιδερμικού φραγμού, περίπου ~70% των ποντικών Spink5-/-Klk5-/- πεθαίνουν στο τέλος της πρώτης εβδομάδας (5-7 ημέρες μετά τη γέννηση). Συνάγεται, λοιπόν, ότι η εξάλειψη της Κlk5 δεν επαρκεί για τη μακροπρόθεσμη επιδιόρθωση της εκτεταμένης βλάβης του φραγμού στο σύνδρομο Netherton. Μια άλλη μελέτη που δημοσιεύθηκε πρόσφατα προτείνει ότι για την αποτελεσματική (μακροπρόθεσμη) επιδιόρθωση της λειτουργίας του δερματικού φραγμού απαιτείται η ταυτόχρονη απαλοιφή των πρωτεασών ΚLK5 και KLK7, καθώς η ταυτόχρονη εξάλειψη των γονιδίων Κlk5 και Klk7 σε ποντικούς Spink5-/- είχε ως αποτέλεσμα την πλήρη και διαρκή/σταθερή αποκατάσταση του φραγμού (Κasparek et al., 2016). Ωστόσο, η φαρμακολογική χορήγηση συνδυασμού (κοκτέιλ) αναστολέων ειδικών για τις πρωτεάσες ΚLK5 και KLK7 παρουσιάζει σημαντικό μειονέκτημα καθώς δεν υφίστανται ειδικοί και εκλεκτικοί αναστολείς για την KLK7, ενώ μικρομοριακοί αναστολείς της ΚLK5 βρίσκονται σε ανάπτυξη από μεγάλη φαρμακοβιομηχανία (Personal communication; undisclosed). Ως εκ τούτου, διερευνήσαμε κατά πόσον η από κοινού αναστολή της πρωτεάσης KLK5 και γνωστών μονοπατιών που εμπλέκονται στην ιδιοσυστατική φλεγμονή που χαρακτηρίζει το σύνδρομο Netherton θα μπορούσε να είναι μια αποτελεσματική εναλλακτική θεραπευτική προσέγγιση. Για να αξιολογηθεί η υπόθεση αυτή αναπτύχθηκαν τα νεοφανή προκλινικά ζωικά πρότυπα: [1] Spink5-/-Klk5-/-Camp-/- και [2] Spink5-/-Klk5-/-Τnfα-/- στα οποία, επιπροσθέτως του γονιδίου Klk5, έχει στοχευθεί για αδρανοποίηση το γονίδιο Camp που κωδικοποιεί το πρόδρομο μόριο της καθελισιδίνης (παράγοντας φυσικής ανοσίας) ή το γονίδιο Tnfα (παράγοντας επίκτητης ανοσίας), αντίστοιχα. Το ποσοστό μετανεογνικής θνησιμότητας δεν βελτιώθηκε στα ποντίκια Spink5-/-Klk5-/-Camp-/-, ωστόσο στον πληθυσμό που ενηλικιώθηκε παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση του χρόνου επιβίωσης καθώς κάποια ποντίκια Spink5-/-Klk5-/-Camp-/- επέζησαν έως και για 1 χρόνο, ενώ κανένα ποντίκι Spink5-/-Klk5-/- δεν έζησε περισσότερο από 8 μήνες. Ωστόσο, τα ενήλικα ποντίκια Spink5-/-Klk5-/-Camp-/- και Spink5-/-Klk5-/- εμφάνισαν αυξημένη αποφολίδωση και φλεγμονή στο δέρμα και σημαντική βλάβη του επιδερμικού φραγμού με αποτέλεσμα τον θάνατο. Κατά την αυτοψία στα ποντίκια αυτά παρατηρήθηκαν αιμορραγικές περιοχές στο στομάχι, ωστόσο η έκταση τους ήταν μικρότερη και η εμφάνιση βελτιωμένη στα ενήλικα ποντίκια Spink5-/-Klk5-/-Camp-/-. Η αιτιολογία και οι υποκείμενοι μοριακοί μηχανισμοί δεν διερευνήθηκαν στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής. Σημαντική βελτίωση παρατηρήθηκε στα ποντίκια Spink5-/-Klk5-/-Tnfa-/-, στα οποία η βλάβη του δερματικού φραγμού αποκαταστάθηκε πλήρως κατά τη μετανεογνική περίοδο, με απουσία αποφολίδωσης μακροσκοπικά που επιβεβαιώθηκε και με: [1] με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SΕΜ, scanning electron microscopy), αφού δεν ανιχνεύθηκαν αποκολλημένα κερατινοκύτταρα και η μορφολογία της εξωτερικής επιφάνειας της επιδερμίδας δεν διέφερε από εκείνη των ποντικών αγρίου τύπου και [2] με χρώση βιοψιών δέρματος με αιματοξυλίνη/ηωσίνη διαπιστώθηκε φυσιολογική δομή του δέρματος και απουσία αποκόλλησης της κεράτινης στιβάδας από την υποκείμενη κοκκιώδη στιβάδα, που είναι χαρακτηριστική στα ποντίκια Spink5-/-. Επιπροσθέτως, κατά τη μετανεογνική περίοδο, στα ποντίκια Spink5-/-Klk5-/-Tnfa-/- δεν εντοπίσθηκε υπερκεράτωση, παρακεράτωση ή ακάνθωση σε αντίθεση με τα ποντίκια Spink5-/-Klk5-/-, και επιπλέον ανιχνεύθηκαν φυσιολογικά επίπεδα έκφρασης δεσμογλεΐνης 1, κορνεοδεσμοσίνης, δεσμοκολλίνης 1 και των δεικτών διαφοροποίησης ινβολουκρίνη, λορικρίνη, και κερατίνη 5, υποδεικνύοντας ότι έχει αποκατασταθεί στα φυσιολογικά επίπεδα η έκτοπη πρωτεολυτική διάσπαση των δεσμοσωμάτων και τα κερατινοκύτταρα είναι φυσιολογικώς διαφοροποιημένα, αντίστοιχα. Όντως, με ζυμογραφία in situ, δεν εντοπίσθηκε μη φυσιολογική πρωτεόλυση στην επιδερμίδα των ποντικών Spink5-/-Klk5-/-Tnfa-/- σε αντίθεση με τα ποντίκια Spink5-/- και Spink5-/-Klk5-/-. Επιπλέον, δεν επάγεται φλεγμονή όπως υποδηλώνεται από τα χαμηλά επίπεδα φλεγμονωδών κυτταροκινών και την απουσία διηθημένων σιτευτικών κυττάρων στην επιδερμίδα, καθώς και από την απουσία ενεργοποίησης του υποδοχέα Par2 και το γεγονός ότι εκφράζονται σε φυσιολογικά επίπεδα το Tslp και οι φλεγμονώδεις κυτταροκίνες Il-1β, Ιl-23, και Il-17α. Τουλάχιστον 80% των ποντικών Spink5-/-Klk5-/-Tnfa-/- επιβίωσε και ενηλικιώθηκε φυσιολογικά. Η μόνη μακροσκοπική διαφορά που έχει εντοπισθεί σε σύγκριση με τα ποντίκια αγρίου τύπου, είναι κυκλική απώλεια και ανάκτηση του τριχώματος. Με βάση τα ευρήματα αυτά προτείνουμε για πρώτη φορά ότι η φαρμακολογική στόχευση της πρωτεάσης KLK5 με ειδικούς μικρομοριακούς αναστολείς σε συνδυασμό με εγκεκριμένους αντι-TNFα βιολογικούς παράγοντες που χρησιμοποιούνται ευρέως για διάφορες κλινικές ενδείξεις, θα μπορούσε να αποτελέσει μια φαρμακολογική προσέγγιση για την αποτελεσματική θεραπεία του συνδρόμου Netherton.ΜΕΡΟΣ ΙΙ: Διερεύνηση του ρόλου της πρωτεάσης KLK5 στον καρκίνο του δέρματος-Καταστολή της πρώιμης ογκογένεσης στο δέρμα στα ποντίκια με ανεπάρκεια Klk5 μέσω ενίσχυσης της μικροδομής της επιδερμίδας και ισχυρότερων συνδέσεων μεταξύ παρακείμενων κερατινοκυττάρων. Πολλές μελέτες έχουν υποδείξει ότι η KLK5 εμπλέκεται σε διάφορους τύπους καρκίνου καθώς η έκφρασή της έχει παρατηρηθεί αλλαγμένη σε όγκους ασθενών με καρκίνο μαστού, εντέρου, όρχεων, νεφρών (Emani et al., 2008). Ωστόσο, οι υποκείμενοι μοριακοί μηχανισμοί δεν είναι γνωστοί. Στο πλαίσιο της παρούσας μελέτης διερευνήθηκε in vivo κατά πόσον η KLK5 εμπλέκεται στον καρκίνο του δέρματος, όπου δεν έχει μέχρι σήμερα μελετηθεί. Όπως αναπτύχθηκε παραπάνω, η KLK5 εμπλέκεται στη φλεγμονή που παρατηρείται σε δερματικές νόσους όπως το σύνδρομο Netherton. Με εφαρμογή DMBA/TPA ή DMBA/DMBA στην επιδερμίδα, σύμφωνα με καθιερωμένα πρωτόκολλα, προκλήθηκε χημική καρκινογένεση στο δέρμα ποντικών αγρίου τύπου και ποντικών Klk5-/-. Βρέθηκε ότι τα ποντίκια Klk5-/- είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά στη δημιουργία καλοήθων όγκων του δέρματος μετά από επαγωγή χημικής καρκινογένεσης. Αντίθετα, οι πολύ λιγότεροι σε αριθμό όγκοι που αναπτύχθηκαν στα ποντίκια Klk5-/- εξαλλάχθηκαν προς κακοήθεις φαινοτύπους (πρωτοπαθείς και διηθητικούς όγκους) ταχύτερα στα ποντίκια Klk5-/-. Επειδή η χρόνια φλεγμονή θεωρείται απαραίτητος παράγοντας για την ανάπτυξη καρκίνου του δέρματος, υποθέσαμε ότι η εξάλειψη της πρωτεάσης Klk5 θα μπορούσε να μειώσει τη φλεγμονή λόγω μη ενεργοποίησης του σηματοδοτικού μονοπατιού Par2-Nf-κb. Ωστόσο, κατά την προαγωγή με TPA, η φλεγμονή ήταν πολύ πιο έντονη στην επιδερμίδα των ποντικών Klk5-/- από ό,τι στα ποντίκια αγρίου τύπου. Δημιουργήσαμε το ζωικό πρότυπο Tg-NglKlk5-/- προκειμένου να μελετήσουμε την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα Nf-κb in vivo και σε πραγματικό χρόνο. Tο ζωικό πρότυπο Tg-NglKlk5-/- δημιουργήθηκε με διασταύρωση των Κlk5-/- ποντικών με τα διαγονιδιακά ποντίκια Ngl, στα οποία έχει ενσωματωθεί το γονίδιο αναφοράς της λουσιφεράσης που βρίσκεται υπό τον έλεγχο του υποκινητή του Nf-κb (Everhart et al., 2006). Αντίθετα προς το αναμενόμενο, διαπιστώθηκε ότι ο παράγοντας Nf-κb ενεργοποιείται πολύ περισσότερο στο δέρμα των ποντικών Klk5-/- μετά από εφαρμογή TPA, παρατήρηση που δεν αιτιολογεί την ανθεκτικότητα στη χημική καρκινογένεση. Έτσι, διερευνήσαμε με ποιους μοριακούς μηχανισμούς η ανεπάρκεια Klk5 δημιουργεί ανθεκτικότητα στον σχηματισμό όγκων κατά τα πρώιμα στάδια καρκινογένεσης στο δέρμα. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, η β-κατενίνη αναστέλλει την ενεργοποίηση του NF-κB σε καρκινικά κύτταρα (Du et al., 2009; Deng et al., 2002). Για τούτο ελέγξαμε κατά πόσον επηρεάζεται η ενεργοποίηση της β-κατενίνης απουσία Klk5. Όντως, η εφαρμογή TPA σε ποντίκια Klk5-/- δεν οδήγησε σε ενεργοποίηση της β-κατενίνης (που υποδηλώνεται από τη μετατόπιση της β-κατενίνης στον πυρήνα), όπως έγινε στα ποντίκια αγρίου τύπου. Αντίθετα, στα ποντίκια Klk5-/- η β-κατενίνη βρέθηκε ακινητοποιημένη στο κυτταροδιάλυμα. Η αδυναμία ενεργοποίησης του σηματοδοτικού μονοπατιού της β-κατενίνης παρέχει μια πιθανή εξήγηση γιατί αναπτύχθηκαν πολύ λιγότεροι όγκοι στα ποντίκια Κlk5-/- διότι, με βάση προηγούμενες μελέτες, η ενεργοποίηση της σηματοδότησης που διαμεσολαβείται από τη β-κατενίνη προάγει τη δημιουργία καρκίνου του δέρματος (Beronja et al., 2013). Με μικροσκοπία ατομικής ισχύος (AFM, atomic force microscopy) μετρήθηκε η ισχύς και οι μηχανικές ιδιότητες του δέρματος και βρέθηκε ότι το δέρμα των ποντικών Κlk5-/- έχει αυξημένη μηχανική αντοχή η οποία πιθανόν να εξηγεί τη μειωμένη ενεργοποίηση της β-κατενίνης λόγω καθήλωσης αυτής στο κυτταρoδιάλυμα. Τα περισσότερα σε αριθμό και μεγαλύτερα σε μήκος δεσμοσώματα παρέχουν ισχυρότερες συνδέσεις μεταξύ παρακείμενων κερατινοκυττάρων αυξάνοντας την ισχύ του δέρματος των ποντικών Κlk5-/-. Επιπλέον, στην επιδερμίδα των ποντικών Klk5-/- η αναστολή της ογκογόνου σηματοδότησης διαμεσολαβούμενης από τη β-κατενίνη είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή απόπτωσης, όπως προσδιορίσθηκε με τη μέθοδο TUNEL, και πιθανά την απομάκρυνση επιδερμικών κερατινοκυττάρων που φέρουν μεταλλάξεις. Αυτό εξηγεί περαιτέρω γιατί στα ποντίκια Klk5-/- σχηματίσθηκε πολύ μικρότερος αριθμός όγκων. Συνοπτικά, αξιοποιώντας το ζωικό πρότυπο Κlk5-/- βρήκαμε ότι η πρωτεάση Klk5 εμπλέκεται στα πρώιμα στάδια σχηματισμού όγκων στο δέρμα λόγω αναστολής της ογκογόνου σηματοδότησης που διαμεσολαβείται από τη β-κατενίνη. Συνολικά, η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει να συμβάλλει στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στη φλεγμονή του δέρματος και να διευκρινίσει τον ρόλο της πρωτεάσης Klk5, ώστε να αναπτυχθούν καινοτόμες θεραπευτικές προσεγγίσεις για βαρειές νόσους του δέρματος που χαρακτηρίζονται από υπεραποφολίδωση και συστηματική φλεγμονή όπως το σύνδρομο Netherton, αλλά και για κοινές ασθένειες όπως η ατοπική δερματίτιδα καθώς οι υποκείμενοι μοριακοί μηχανισμοί πιθανόν να είναι κοινοί. Επιπλέον, η παρούσα μελέτη προτείνει έναν πιθανό ρόλο της πρωτεάσης KLK5 στα πρώιμα στάδια της δημιουργίας όγκων στο δέρμα.