Χολινεργικές δράσεις στον ιππόκαμπο επίμυος μετά από προκλητούς σπασμούς κατά την ανάπτυξη

Abstract

An early-life Status Epilepticus occurrence may be linked to enhanced long-term seizure recurrence facilitation and cognitive impairment. In this study an in vivo model of sustained generalized seizures is applied to immature rats and the long-term cholinergic/muscarinic –a neuromodulatory system implicated both in seizure generation and physiological cognitive function- effects are evaluated in in vitro preparations of septal and temporal hippocampus –a structure associated both with the most common form generalized epilepsy, temporal lobe epilepsy, and crucial processes for memory and learning- under interictal-like epileptiform activity induction – since interictal spiking may be facilitating seizure generation and is linked to transient cognitive impairment- toaccount for the increased neuronal excitability or synchronization, resembling similar manifestations in humans.A total of 149 (using no more than 2 slices per animal) transverse septal or temporal hippocampal slices from adult Sprague-Dawley rats, normal (n=58) or pentylenetetrazole (PTZ)-treated (n=41) (where a >20 min generalized convulsion had been provoked at postnatal day 20 by a 60-90mg/kg PTZ i.p. injection) were perfused with aCSF (i) with nominally 0-Mg2+ or (ii) containing 50µM 4-aminopyridine (4-AP). CA3 area interictal like epileptiform discharges (IEDs) were recorded extracellularly and their rates of occurrence were quantified in Hz.In a subset of the temporal slices (n=17) the entorhinal cortex was preserved, and simultaneous recordings were made in the CA3a pyramidal field and the MECV-VI layers, during perfusion with the Mg-free aCSF. The rates of IED occurrence as well as the duration of the MEC discharges were measured. Results are presented as average ± s.d. All datasets were checked for normality compliance before performing statistical hypotheses tests.An initial comparison between slices of male and female rats showed no significant difference and these two subsets were subsequently used as a single pooled set. The septal slices displayed a lower baseline discharge rate in comparison to the temporal slices, in both media and in all subgroups, in accordance to previous literature findings (Gilbert et al., 1985; Papatheodoropoulos et al., 2005). Perfusion with the anticholinesterase eserine (10µM) provoked an increase in discharge rates by 67% to 90% in N (temporal and septal) and PTZ temporalslices and by 199% in PTZ septal slices, in the Mg-free aCSF (N-T: 167±79% n=25, N-S:174±66% n=12, PTZ- T:190±92% n=20, PTZ-S:298±177% n=15), though similar increments in all groups in the 4-AP aCSF (N-T: 237±158 n=15, N-S: 249±140% n=10 ,PTZ-T: 261±198% n=9, PTZ-S: 221±50% n=5). The effect of eserine was reversible by the muscarinic antagonist atropine (1µM).Extrinsic stimulation with 1µM carbachol provoked greater increases but also more variable and with less decipherable between slice groups, possibly because of the smaller sample sizes (in Mg-free, N-T: 302±258% n=7, N-S: 443±356% n=6, PTZ-T: 244±146% n=6, PTZ-S: 221±43% n=4, and in 4-AP, N-T: 257±102% n=8, N-S: 197±122 n=3, PTZ-T: 258±81% n=6, PTZ-S: 254±334 n=6).Muscarinic antagonism by perfusion of 1µM atropine (perfused alone) induced a different pattern of frequency decreases between slice groups (in Mg-free, N-T: 80±26% n=19, N-S: 86±31% n=6, PTZ-T: 92±18% n=7, PTZS: 75±18% n=4, and in 4-A-P, N-T: 35±36% n=5, N-S: 91±5% n=6, PTZ-T: 67±32% n=5, PTZ-S: 49±34% n=5), indicating a shift in baseline muscarinic contribution to the excitability in the 4-AP model in the PTZ group, viewed as an increased effect in the septal slices vs. temporal ones instead of the enhanced response in temporal vs. septal slices from normal rats. A similar tendency may be present in the Mg-free model but is less pronounced, perhaps due to the more limited frequency decrements.The experiment with the combined slices showed a distinct difference in MECV-VI discharge rate between normal (0.29±0.29Hz, n=8) and PTZ rat slices (0.42±0.29Hz, n=6). The difference disappeared after cutting the Schaffer collaterals in CA1 (in PTZ slices a drop to 0.18±0.29Hz occurred; no difference in normal rat slices 0.27±0.29Hz). The CA3 discharge rate remained unaffected across cuts (0.65±0.29Hz, n=8 with differences between cuts of a <0.03Hz range, in normal rat slices, and 0.47±0.29Hz, n=6 with differences between cuts of a <0.05Hz range, in PTZ rat slices). Furthermore, cutting the SC caused a visible increase in the duration of PTZ MEC discharges vs. a less pronounced change in normal slices. The duration had a shorter and a longer duration component. The short duration component doubled from 446 to 823msec and the longer increased by 20% from 1022 to 1238msec in N slices. In PTZ rat slices, the fast component increased by 50% from 446 to 665msec and the slower one by 25 percent from 918 to 1152msec. Our results demonstrate that a generalized and sustained early-life seizure (as an equivalent to generalized convulsive SE) enhances the response of the hippocampus to ACh availability increases in generating epileptiform discharges. The effect is more specific to animals of epileptic history in a model of concurrent NMDAR activation and more so in the septal hippocampus. This may indicate an increased probability of seizure generation or propagation -in individuals having suffered even no more than one single SE event in childhood- under a variety of physiological or pathological conditions in which cholinergic/muscarinic neuromodulation and NMDARmediatedglutamatergic components are combined, and possibly explains certain aspects of long-term cognitive deficits. Hippocampal output, also seems to be enhanced in the same conditions and after the early-life seizure, possibly leading to robust synchronization in adjacent cortical areas, converging to seizure spreading facilitation and partially substantiating the cognitive impairment outcome, at least in the case of interictal spiking (Kleen et al., 2010).

Εµφάνιση του Status epilepticus σε νεαρή ηλικία µπορεί να συνδέεται µε µακροπρόθεσµη διευκόλυνση παραγωγής επιληπτικών κρίσεων. Στην παρούσα µελέτη ένα in vivo µοντέλο παρατεταµένων γενικευµένων κρίσεων εφαρµόζεται σε ανώριµους αρουραίους και τα µακροπρόθεσµα χολινεργικά/µουσκαρινικά αποτελέσµατα –καθώς πρόκειται για ένα νευρορρυθµιστικό σύστηµα εµπλεκόµενο και στην παραγωγή κρίσεων και στη φυσιολογική γνωσιακή λειτουργίααξιολογούνται σε in vitro παρασκεύασµα διαφραγµατικού και κροταφικού ιπποκάµπου –µιας δοµής που σχετίζεται µε τη συνηθέστερη µορφή γενικευµένης επιληψίας, την επιληψία κροταφικού λοβού, και που κατέχει σηµαντικό ρόλο στις διαδικασίες µνήµης και µάθησης- υπό την επαγωγή επιληπτοειδούς δραστηριότητας µεσοκρισικού τύπου –καθώς οι µεσοκρισικές εκφορτίσεις ενδέχεται να διευκολύνουν την παραγωγή επιληπτικών κρίσεων, και συνδέονται επίσης µε παροδικές γνωσιακές διαταραχές- ώστε να επιτύχουµε παρόµοιες συνθήκες αυξηµένου συγχρονισµού και διέγερσης µε αυτές που πραγµατοποιούνται σε ανάλογες συνθήκες στον άνθρωπο. 149 εγκάρσιες κροταφικές ή διαφραγµατικές τοµές ιπποκάµπου (µε µέγιστο όριο χρήσης 2 τοµών ανά πειραµατόζωο) παρασκευάστηκαν από ενήλικους (>2µηνών) αρουραίους Sprague-Dawley φυσιολογικούς (n=58) ή που είχαν υποστεί µια παρατεταµένη (>20λεπτά) γενικευµένη κρίση µε 60-90mg/kg pentylenetetrazole (“PTZ”) και διαβράχηκαν είτε µε τΕΝΥ άνευ µαγνησίου είτε µε τΕΝΥ µε 50µM 4-αµινοπυριδίνης. Οι επιληπτοειδείς εκφορτίσεις µεσοκρισικού τύπου της περιοχής CA3 καταγράφηκαν εξωκυττάρια, και ο ρυθµός επανεµφάνισής τους µετρήθηκε ως συχνότητα (Hz). Σε µέρος των τοµών (n=17) διατηρήθηκε και ο µέσος ενδορρινικός φλοιός και πραγµατοποιήθηκαν φυσιολογικούς (n=58) ή που είχαν υποστεί µια παρατεταµένη (>20λεπτά) γενικευµένη κρίση µε 60-90mg/kg pentylenetetrazole (“PTZ”) και διαβράχηκαν είτε µε τΕΝΥ άνευ µαγνησίου είτε µε τΕΝΥ µε50µM 4-αµινοπυριδίνης. Οι επιληπτοειδείς εκφορτίσεις µεσοκρισικού τύπου της περιοχής CA3καταγράφηκαν εξωκυττάρια, και ο ρυθµός επανεµφάνισής τους µετρήθηκε ως συχνότητα (Hz). Σεµέρος των τοµών (n=17) διατηρήθηκε και ο µέσος ενδορρινικός φλοιός και πραγµατοποιήθηκαν στην συνεισφορά των µουσκαρινικών υποδοχέων στην βασική κατάσταση στο µοντέλο τηςαµινοπυριδίνης, στην οµάδα των τοµών PTZ πειραµατοζώων, που εµφανίστηκε ως αυξηµένοαποτέλεσµα στις διαφραγµατικές τοµές έναντι των κροταφικών, αντί της ενισχυµένης απόκρισηςστις κροταφικές έναντι των διαφραγµατικών τοµών φυσιολογικών πειραµατοζώων. Μια παρόµοιατάση ίσως υπάρχει στο µοντέλο µε τΕΝΥ άνευ µαγνησίου αλλά είναι λιγότερο έντονο, πιθανώς λόγωτων λιγότερο εκτεταµένων µειώσεων.Το πείραµα µε τις συνδυασµένες τοµές έδειξε µια ευδιάκριτη διαφορά στον ρυθµό εκφορτίσεων τωνστιβάδων V-VI του µέσου ενδορρινικού φλοιού µεταξύ τοµών φυσιολογικών (0.29±0.29Hz, n=8) και PTZ πειραµατοζώων (0.42±0.29Hz, n=6). Η διαφορά αυτή µειώθηκε µετά την διακοπή τωνπαραπλεύρων ινών Schaffer στην περιοχή CA1 (στις τοµές των PTZ πειραµατοζώων µειώθηκε ησυχνότητα σε 0.18±0.29Hz, χωρίς καµµία µεταβολή της συχνότητας των τοµών φυσιολογικώνπειραµατοζώων). Ο ρυθµός εκφορτίσεων της CA3 παρέµεινε ανεπηρέαστος από τις τοµές(0.65±0.29Hz, n=8 µε εύρος διαφορών µεταξύ τοµών <0.03Hz σε τοµές φυσιολογικών πειραµατοζώων, και 0.47±0.29Hz, n=6 µε εύρος διαφορών µεταξύ τοµών <0.05Hz σε τοµές PTZ πειραµατοζώων).Επιπλέον, η διακοπή των ινών Schaffer προκάλεσε µια ορατή αύξηση της διάρκειας των εκφορτίσεων στον ενδορρινικό φλοιό των PTZ πειραµατοζώων έναντι µικρότερης µεταβολής στις τοµές των φυσιολογικών. Η διάρκεια των εκφορτίσεων είχε µια σύντοµη και µια πιο παρατεταµένη συνιστώσα.Στις τοµές των φυσιολογικών πειραµατοζώων η σύντοµη συνιστώσα διπλασιάστηκε από 446 σε 823msec και η παρατεταµένη αυξήθηκε κατά 20% από 1022 σε 1238msec. Στις τοµές των PTZπειραµατοζώων η σύντοµη συνιστώσα αυξήθηκε κατά 50% από 446 σε 665msec και η παρατεταµένη αυξήθηκε κατά 25% από 918 σε 1152msec.Τα αποτελέσµατα δείχνουν ότι µια παρατεταµένη γενικευµένη κρίση κατά την ανάπτυξη (ωςανάλογο του γενικευµένου SE µε σπασµούς) ενισχύει την απόκριση του ιπποκάµπου σε αυξήσεις της διαθέσιµης ακετυλοχολίνης προς την παραγωγή επιληπτοειδών εκφορτίσεων. Το φαινόµενο είναι πιο αυξηµένο σε πειραµατόζωα επιληπτικού ιστορικού, µε ένα µοντέλο ταυτόχρονης ενεργοποίησης των υποδοχέων NMDA, και σε µεγαλύτερο βαθµό στον διαφραγµατικό ιππόκαµπο. Το εύρηµα αυτό µπορεί να δείχνει µια αυξηµένη πιθανότητα παραγωγής ή εξάπλωσης κρίσεων –σε άτοµα που έχουν υποστεί έστω ένα µοναδικό επεισόδιο SE στην παιδική ηλικία- κάτω από ποικίλες συνθήκες συνδυασµένης χολινεργικής/µουσκαρινικής νευρορρύθµισης και γλουταµατεργικής NMDAR µεσολαβούµενης διαβίβασης, και ενδεχοµένως κάποιες όψεις των µακροπρόθεσµων γνωσιακών δυσλειτουργιών. Η έξοδος του ιπποκάµπου επίσης φαίνεται ενισχυµένη στις ίδιες συνθήκες και µετά από µια επιληπτική κρίση σε νεαρή ηλικία, πιθανώς οδηγώντας σε ισχυρότερο/σταθερότερο συγχρονισµό παρακείµενων φλοιικών περιοχών, συγκλίνοντας έτσι στην διευκόλυνση της εξάπλωσης επιληπτικών κρίσεων και µερικώς αιτιολογώντας το αποτέλεσµα της γνωσιακήςδιαταραχής, τουλάχιστον στην περίπτωση των µεσοκρισικών εκφορτίσεων (Kleen et al., 2010).