Μελέτη και κλινική αξιολόγηση του γονιδίου NES1 (KLK10) καθώς και των εναλλακτικών μεταγράφων του στον καρκίνο του παχέος εντέρου

Abstract

Colon cancer is the most frequent malignant disease of the digestive system in USA and Europe. In our country, colon cancer ranked fourth among causes of death from neoplasms. The biomarkers used in modern clinical practice are the Carcinoembryonic Antigen (CEA), the Carbohydrate Antigen 19-9 (CA 19-9), the 72-4 Cancer Antigen (CA72-4) and the Tissue plasminogen activator (PLAT). Although several prognostic and predictive markers for colon cancer have been recognized, very few of them are currently used in clinical practice.The human tissue kallikrein gene family is the largest contiguous gene family of proteases in the human genome, with no intervention from other genes. It is a very attractive field of study, as one of its members, the famous PSA/KLK3, is the most accepted and widely used cancer biomarker, until today. Studies have suggested other family members as potential biomarkers for prognosis or/and prediction of colon cancer, including KLK4 and KLK7, at mRNA level, and KLK4, KLK7 and KLK11, at protein level. KLK10 gene is a new member of the kallikrein tissue family. Several studies have been conducted to assess the potential role of KLK10 as a tumor marker. Due to its higher levels in tumor tissues and serum of patients with ovarian cancer, KLK10 has been proposedas diagnostic and prognostic marker for ovarian cancer, in combination with the already used marker CA125, for increased diagnostic sensitivity. In this thesis, we performed clinical evaluation of the KLK10 gene for its possible application as a new prognostic marker for colorectal cancer. The mRNA expression study was performed with conventional RT-PCR and quantitative PCR methodology in real-time (real-time PCR), and the protein was detected and measured by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Analytical protocols were developed to determine the mRNA expression of KLK10 gene in colorectal cancer based on reverse transcription (RT), polymerase chain reaction (PCR) and quantitative real-time PCR (real-time PCR) methodology. Detection and quantification of protein KLK10 performed by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). There weren’t any ready kit to be used for the abovementioned experiments, all the assays were developed in our lab, so we also performed quality control in order to ensure the reliability of the results. We collected a statistically significant size from cancerous and non- cancerous colon tissue samples (194 tissues), from patients with complete clinical history. For the analysis of data, an extensive biostatistical analysis was performed. We used parametric and nonparametric methodologies, ROC analysis, Kaplan-Meier survival analysis, as well as univariate and multivariate Cox regression analysis. The results obtained showed that the mRNA expression of the KLK10 gene is statistically associated with several clinicopathological parameters, including Duke’s Stage (P=0.036), Grade (P=0.025), lymph nodes status (P=0.046) and distant organs metastasis (P=0.027). The Kaplan Meier survival analysis showed statistically significantly shorterpossibility of disease-free (DFS) and overall survival (OS) of patients with positive KLK10mRNA expression (P=0.014 and P=0.020, respectively). The expression of KLK10 protein was statistically significant higher in tumor samples than in normal counter parts (P<0.001). In conclusion, the cancerous colon tissues examined showed a higher expression of KLK10gene. The over-expression of this appears to be associated with poor prognosis in patients with colon cancer and may constitute a useful novel molecular biomarker. We then cultured colorectal adenocarcinoma cell line HT-29, for which we constructed viability curves, followed by treatment with chemotherapy drugs used in systematic treatment of colon cancer (fluorouracil, oxaliplatin), as well as with other widely used cancer drugs (taxotere, cisplatin, gemcitabine). For the first time, after the treament with the administered agent, we removed the agent and we continued the cell culture, in order to evaluate whether the cells continue to die or if they revert to normal cell division,when the drug is removed. Then, we evaluated the mRNA expression profiles of KLK10 gene, as well as other genes involved in apoptosis: BCL2, BCLX, MCL1, BAX, BAK1, BIM,BID, PUMA (BBC3), NΟΧΑ (PMAIP1), BIRC5 (Survivin), and P21 (CDKN1A). KLK10 mRNA expression levels were elevated, after the treatment with fluorouraciland cisplatin, while smaller scale changes were observed with the treatment with other drugs. Finally, what was very interesting, was the fact that KLK10 mRNA pattern of expression followed the mRNA pattern of expression of the proapoptotic NOXA gene. Regarding the BCL2 family members, depending on the chemotherapeutic agentused, other members expression levels increased, while others decreased and others remained the same. The transcriptional activation of some members in each treatment with cytotoxic agent, however, suggests that, depending on the stimulus, the proapoptotic members begin their path to apoptosis. The position of each molecule may be of strategic importance in order to ensure the pathway of apoptosis. This could reveal a unified role inproapoptotic BH3-only family members. Perhaps such a mechanism is established by the transcriptional activation of different members of the family, during the treatment with different chemotherapeutic agents. It is worth noting, finally, that the mRNA expression of the antiapoptotic BCL2 gene was down regulated in the presence of all the above mentioned cytotoxic agents, which is in agreement with previous studies where over expression of the gene was combined with tolerance to chemotherapy. A second important point that emerges from this study, is the use of taxotere and cisplatin in colon cancer chemotherapy. From treatment with both agents, the cells continued to die, even after their removal from the flask. Finally, the expression of the KLK10 gene, at both mRNA and protein level, has features of an unfavorable prognostic marker for colon cancer, as it is associated with shorter disease free and overall survival, and this is the most important result of this thesis.Its transcriptional activation after treatment with chemotherapeutic agents, perhaps assigns it a possible role as a biomarker for response to chemotherapy. The understanding of regulation mechanisms and the discovery of the physiological substrate of this enzyme, willlead to its evaluation as a potential target for colon cancer treatment.

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η πιο συχνή κακοήθης πάθηση του πεπτικού συστήματος σε ΗΠΑ και Ευρώπη. Στη χώρα μας, ο καρκίνος του παχέος εντέρου καταλαμβάνει την τέταρτη θέση των αιτιών θανάτου από νεοπλάσματα. Οι κυριότεροι καρκινικοί δείκτες παχέος εντέρου που χρησιμοποιούνται στη σύγχρονη κλινική πράξη είναι το καρκινοεμβρυικό αντιγόνο CEA (carcinoembryonic antigen), το υδατανθρακικό αντιγόνοCA 19-9 (carbohydrate antigen 19-9), το καρκινικό αντιγόνο CA 72-4 (cancer antigen 72-4)και ο ενεργοποιητής του πλασμινογόνου των ιστών PLAT (tissue plasminogenactivator).‘Έχουν αναγνωριστεί αρκετοί προγνωστικοί δείκτες και δείκτες πρόβλεψης για τον καρκίνο του παχέος εντέρου, αν και πολύ λίγοι από αυτούς χρησιμοποιούνται σήμερα στην κλινική πράξη.Η οικογένεια γονιδίων των ανθρώπινων ιστικών καλλικρεϊνών είναι η μεγαλύτερη συνεχόμενη γονιδιακά οικογένεια πρωτεασών στο ανθρώπινο γονιδίωμα, χωρίς παρέμβαση από άλλα γονίδια. Aποτελεί σημαντικό τομέα μελέτης, καθώς ένα από τα μέλη της, τοPSA/KLK3, είναι ο πλέον αποδεκτός και ευρέως χρησιμοποιημένος καρκινικός δείκτης,μέχρι σήμερα. Συγκεκριμένα για τον καρκίνο του παχέος εντέρου, μελέτες έχουν υποδείξει άλλα μέλη της οικογένειας ως πιθανούς δείκτες πρόγνωσης ή/και πρόβλεψης,συμπεριλαμβανομένων των KLK4 και KLK7, σε επίπεδο mRNA, καθώς και KLK5, KLK7και KLK11,σε επίπεδο πρωτεῒνης. Το γονίδιο της KLK10 είναι ένα νέο μέλος της οικογένειας των ιστικών καλλικρεϊνών. Αρκετές μελέτες έχουν διεξαχθεί προκειμένου να αξιολογηθεί ο πιθανός ρόλος της KLK10 ως καρκινικός δείκτης. Λόγω των υψηλότερων επιπέδων της στους καρκινικούς ιστούς και στον ορό ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών, η KLK10 έχει προταθεί ως διαγνωστικός και προγνωστικός δείκτης για τον καρκίνο των ωοθηκών, σε συνδυασμό με τον ήδη χρησιμοποιούμενο δείκτη CA125, για αύξηση της διαγνωστικής ευαισθησίας. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, έγινε μελέτη της έκφρασης και κλινική αξιολόγηση του γονιδίου KLK10 για πιθανή εφαρμογή του ως νέο προγνωστικό δείκτη για τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Αναπτύχθηκαν αναλυτικά πρωτόκολλα για τον προσδιορισμό της έκφρασης mRNA του γονιδίου KLK10 στον καρκίνο του παχέος εντέρου,βασιζόμενα στην αντίστροφη μεταγραφή (RT), στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης(PCR) και στη μεθοδολογία ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο (real-time PCR). Η ανίχνευση και ο ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεΐνης KLK10, πραγματοποιήθηκε με ανοσοδοκιμασία ELISA. Δεν υπάρχουν και δεν χρησιμοποιήθηκαν έτοιμα kit για τους παραπάνω προσδιορισμούς αλλά πραγματοποιήθηκε έλεγχος ποιότητας των τεχνικών που αναπτύχθηκαν ώστε να εξασφαλιστεί η αξιοπιστία των προσδιορισμών. Συλλέχθηκε ένα στατιστικά σημαντικό μέγεθος καρκινικών και μη καρκινικών ιστών παχέος εντέρου (194 ιστολογικά δείγματα) από ασθενείς με πλήρες κλινικό ιστορικό. Για την ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε εκτενής βιοστατιστική ανάλυση. Χρησιμοποιήθηκαν παραμετρικές και μη παραμετρικές μεθοδολογίες, ανάλυση ROC, ανάλυση Kaplan Meier,καθώς και ανάλυση μονομεταβλητής και πολυμεταβλητής Cox παλινδρόμησης.Τα αποτελέσματα που προέκυψαν δείχνουν ότι η έκφραση mRNA του γονιδίουKLK10 σχετίζεται σε στατιστικά σημαντικό βαθμό με διάφορες κλινικοπαθολογικές παραμέτρους, συμπεριλαμβανομένων της σταδιοποίησης κατά Dukes (P=0,036), του βαθμού αποδιαφοροποίησης (P=0,025), της μετάστασης στους λεμφαδένες (P=0,046) και της μετάστασης σε απομακρυσμένα όργανα (P=0,027). Η ανάλυση επιβίωσης κατά KaplanMeier έδειξε στατιστικώς σημαντικά μικρότερες πιθανότητες ελεύθερης νόσου (DFS) και ολικής επιβίωσης (OS) των ασθενών με θετική έκφραση mRNA του γονιδίου της KLK10(P=0,014 και P=0,020, αντίστοιχα). Η έκφραση της πρωτεΐνης KLK10 ήταν σε στατιστικά σημαντικό βαθμό (P<0,001) υψηλότερη στα καρκινικά δείγματα απ’ότι στα φυσιολογικά. Συμπερασματικά, στους καρκινικούς ιστούς παχέος εντέρου που εξετάστηκαν παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση του γονιδίου της KLK10. Η υπερέκφραση αυτή φαίνεται να σχετίζεται με δυσμενή πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και μπορεί να συνιστά ένα χρήσιμο νέο μοριακό δείκτη.Στη συνέχεια, έγιναν πειράματα σε καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου ώστε να διαπιστωθεί εάν το γονίδιο KLK10 εμπλέκεται στην ανταπόκριση των ασθενών σε κυτταροστατικά φάρμακα, γεγονός που θα εξηγούσε αρκετά από τα παραπάνω συμπεράσματα. Πιο συγκεκριμένα, έγινε καλλιέργεια καρκινικών κυττάρων της κυτταρικής σειράς ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος HT-29, για την οποία κατασκευάστηκαν καμπύλες βιωσιμότητας. Στη συνέχεια, έγινε επίδραση με χημειοθεραπευτικά φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη συστηματική θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου(φθοροουρακίλη, οξαλιπλατίνη), καθώς και με άλλα, ευρέως διαδεδομένα αντικαρκινικά φάρμακα (σισπλατίνη, δοσεταξέλη, γεμσιταβίνη). Για πρώτη φορά, μετά το τέλος της επίδρασης με το χημειοθεραπευτικό παράγοντα, ακολούθησε καλλιέργεια των εναπομείνοντων κυττάρων σε πλήρες θρεπτικό υλικό, προκειμένου να αξιολογήσουμε εάν τα κύτταρα συνεχίζουν να αποπίπτουν ή εάν επανέρχονται σε κανονική κυτταρική διαίρεση,όταν απομακρύνεται πλέον το φάρμακο. Κατόπιν, μελετήθηκαν οι μεταβολές στο προφίλ έκφρασης mRNA του γονιδίου KLK10 καθώς και άλλων γονιδίων που εμπλέκονται στην απόπτωση: BCL2, BCLX, MCL1, BAX, BAK1, BIM, BID, PUMA (BBC3), NΟΧΑ (PMAIP1),BIRC5 (Survivin), και P21 (CDKN1A).Στο γονίδιο KLK10 παρατηρήθηκαν οι σημαντικότερες μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης του mRNA με την επεξεργασία του με φθοροουρακίλη και σισπλατίνη, ενώ μικρότερης έκτασης ήταν οι μεταβολές κατά την επεξεργασία του με τα υπόλοιπα φάρμακα.Τέλος, ενδιαφέρον παρουσίασε και το γεγονός ότι το πρότυπο έκφρασης mRNA του γονιδίου KLK10 συνολικά ακολουθούσε το πρότυπο έκφρασης του προ-αποπτωτικού γονιδίου NOXA.Όσον αφορά τα μέλη της οικογένειας BCL2, ανάλογα με το χημειοθεραπευτικό παράγοντα που χρησιμοποιήθηκε, παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφοροποιήσεις στο πρότυπο έκφρασής τους. Η μεταγραφική ενεργοποίηση κάποιων μελών σε κάθε επίδραση με κυτταροτοξικό παράγοντα όμως, υποδεικνύει πως, ανάλογα με το ερέθισμα, τα προαποπτωτικά μέλη ξεκινούν το μονοπάτι της απόπτωσης. Η θέση του κάθε μορίου μπορεί να είναι στρατηγικής σημασίας, προκειμένου να εξασφαλιστεί το μονοπάτι της απόπτωσης. Αυτό θα μπορούσε να αποδώσει έναν ενοποιημένo ρόλο στα αντιαποπτωτικά μέλη της οικογένειας που διαθέτουν μόνο BH3 περιοχή. Και ίσως ένας τέτοιος μηχανισμός να αποδεικνύεται από τη μεταγραφική ενεργοποίηση διαφορετικών μελών της οικογένειας κατά την επίδραση με διαφορετικούς χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Αξίζει να αναφερθεί, τέλος, πως τα επίπεδα έκφρασης mRNA του αντιαποπτωτικού γονιδίου BCL2 μειώθηκαν σε κάθε επίδραση με κυτταροτοξικό παράγοντα, το οποίο έρχεται σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες όπου υπερέκφραση του γονιδίου συνδυαζόταν με ανοχή στη χημειοθεραπεία. Ένα δεύτερο σημαντικό σημείο που προκύπτει από την παρούσα μελέτη είναι η χρήση των χημειοθεραπευτικών δοσεταξέλη και σισπλατίνη για την καταπολέμηση του καρκίνου του παχεός εντέρου. Από την εφαρμογή και των δύο παραγόντων, τα κύτταρα συνέχισαν να αποπίπτουν και μετά την αφαίρεσή τους από τη φλάσκα καλλιέργειας.Εν κατακλείδι, η έκφραση του γονιδίου KLK10, τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και σε επίπεδο πρωτεῒνης, αποτελεί δυσμενή προγνωστικό δείκτη στον καρκίνο του παχέος εντέρου, καθώς σχετίζεται με μικρότερη πιθανότητα ελευθέρας νόσου και ολικής επιβίωσης, το οποίο και αποτελεί το σημαντικότερο αποτέλεσμα της παρούσας διατριβής. Η μεταγραφική του ενεργοποίηση μετά από επίδραση χημειοθεραπευτικών παραγόντων, του προσδίδει και ένα πιθανό ρόλο ως δείκτη απόκρισης σε χημειοθεραπεία. Η κατανόηση των μηχανισμών ρύθμισης και η ανακάλυψη των φυσιολογικών υποστρωμάτων του ενζύμου αυτού, θα βοηθήσουν και σε μετέπειτα αξιολόγησή του ως πιθανό στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου.